Наиболее часто встречающимся заболеванием щитовидной железы (ЩЖ), сопровождающимся синдромом тиреотоксикоза, является болезнь Грейвса (БГ). Известно, что БГ – аутоиммунное заболевание, где в качестве аутоантигена-мишени выступает рецептор тиреотропногогормона гипофиза (ТТГ) тироцита. Антитела к рецептору ТТГ (АТ к рТТГ) при БГ носят тиреоидстимулирющий характер [1].

Считается, что аутоиммунные заболевания ЩЖ возникают у генетически предрасположенных лиц после воздействия каких-либо триггеров (например, вирусной или бактериальной инфекции). Особый интерес представляет роль иерсиний в инициации данного заболевания.

Впервые в 1974 г. К. Bech и соавт. [2] обнаружили взаимосвязь между Yersinia enterocolitica и аутоиммунными заболеваниями ЩЖ, определив высокий титр антител к данной бактерии у больных с БГ и тиреоидитом Хашимото. M. Weiss и соавт. [3] выявили на наружной мембране иерсиний участки связывания с тиреотропным гормоном гипофиза – “TТГ-рецептороподобные молекулы”, сходные по антигенному строению с TТГ-рецепторами клеток ЩЖ. Они высказали мысль об “антигенной мимикрии” между определенными участками иерсиний и TТГ-рецепторами клеток ЩЖ. В последующих исследованиях B. Wenzel и соавт. [4] предположили взаимосвязь между аутоиммунными заболеваниями ЩЖ и перенесенным иерсиниозом, полагая, что перекрестная реактивность характерна как для Y. enterocolitica, так и для Y. рseudotuberculosis независимо от серотипов и может играть инициирующую роль в развитии аутоиммунного поражения ЩЖ.

В Японии антитела к Y. enterocolitica серотипов 03, 08, 09 найдены у 70% больных с различной патологией ЩЖ, особенно высокий титр данных антител обнаружен только при БГ [5]. В Израиле, где распространенность иерсиниозов меньше, выявлено 45% серопозитивныхлиц к Y. enterocolitica среди обследованных с тиреопатиями и ни одного из 77 здоровых [3]. Последующие исследования показали, что рТТГ и некоторые белки наружной мембраны Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis, возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза, обладают схожими антигенными детерминантами [6–8]. Показано, что 8 белков Y. enteroсоlitiсa гомологичны с некоторыми аутоэпитоп-содержащими сегментами рТТГ, тиреоглобулина и тиреопероксидазы [7], обнаружена взаимная реактивность между белками иерсиний и антителами при БГ [7, 9]. В недавнем исследовании Z. Wang и соавт. [8] выявлены положительные корреляционные связи между уровнями АТ к рТТГ и антител к Y. enterocolitica, в том числе антител против F-белка наружной мембраны (ompF) иерсиний. Перекрестная реактивность также выявлена между АТ к рТТГ и рекомбинантными белками OmpA, OmpC Y. enterocolitica [10]. Обнаружено, что белок ompF и экстрануклеарная часть рТТГ имеют идентичную аминокислотную последовательность, на основании чего высказано предположение, что белок ompF вовлечен в иммунный механизм секреции АТ к рТТГ и патогенез БГ через механизмы молекулярной мимикрии [8].

M. Giménez-Barcons и соавт. [11] обнаружили экспрессию рТТГ в созревающих тимоцитах при БГ. Они выдвинули гипотезу о том, что многократная непрерывная стимуляция тимоцитов с помощью АТ к рТТГ может привести к порочному циклу многократного улучшения аффинности, благодаря чему антитела к иерсиниям могут перекрестно реагировать с рТТГ.

Противоположной точки зрения об участии иерсиний в патогенезе аутоиммунных заболеваний ЩЖ придерживается R. Volpe [12]. Он считает, что действительно существует перекрестная реактивность (“антигенная мимикрия”), но понимать ее следует в другом контексте. При постановке серологических реакций в сыворотке больных с аутоиммунными заболеваниями ЩЖ с иерсиниозным антигеном во взаимодействие вступают не истинные антитела к иерсиниям, а антитела к клеткам ЩЖ (в частности, АТ к рТТГ) вследствие структурной генетической схожести. Поэтому утверждение о триггерной роли иерсиний в развитии аутоиммунных заболеваний ЩЖ он подвергает сомнению. Выводы R. Volpe косвенно подтверждает высокая корреляция анти-TТГ-рецепторных антител и антииерсиниозных антител у одних и тех же больных. При лечении тиреостатическими препаратами, радиоактивным йодом или тиреоидэктомией наблюдается параллельное снижение титров обоих видов антител [13].

Таким образом, при изучении зарубежной и отечественной литературы обращает внимание противоречивость выводов о роли иерсиний как инициирующего фактора БГ. Однако авторы едины во мнении о необходимости дальнейших углубленных исследований этой проблемы, независимо от их позиции относительно отрицания или подтверждения триггерной роли Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculоsis в развитии аутоиммунных заболеваний ЩЖ.

Изучить значение Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculоsis в развитии болезни Грейвса.

Дизайн исследования

Исследование было наблюдательным одномоментным одноцентровым неконтролируемым с участием пациентов с БГ.

Критерии соответствия

Критерии соответствия: пациенты с БГ в возрасте от 18 до 60 лет, европеоидной расы вне зависимости от пола. Диагноз БГ устанавливался на основании Клинических рекомендаций по диагностике и лечению тиреотоксикоза с диффузным зобом (диффузный токсический зоб, болезнь Грейвса–Базедова), узловым/многоузловым зобом [14].

Критериями исключения больных из исследования явились: наличие других эндокринных заболеваний, сопутствующие хронические заболевания в стадии обострения, текущие острые заболевания и требующие постоянной медикаментозной терапии, беременность и состояние лактации у женщин, отказ пациента от проведения исследования. Пациенты для участия в исследовании подписывали форму информированного согласия.

Условия проведения

Забор биоматериала осуществлялся на базе ГБУЗ Иркутская ордена “Знак Почета” областная клиническая больница г. Иркутска. Исследования проводились на базе лабораторий ГБУЗ Иркутской ордена “Знак Почета” областной клинической больницы, НИИ биомедицинских технологий ФГБОУ ВО Иркутский государственный медицинский университет, ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора г. Иркутска.

Продолжительность исследования

Пациенты с БГ обследовались однократно в период с 2010 по 2011 г.

Описание медицинского вмешательства

Материалом для исследования служила сыворотка венозной крови пациента. Венозная кровь забиралась из локтевой вены путем венепункции в стандартные пробирки с активатором Vacuette 10 мл. Пробирки отстаивались в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугировались в течение 10 мин при 3500 об/мин.

Основной исход исследования

В сыворотке крови больных БГ определяли уровни свободного Т4, ТТГ, АТ к рТТГ, а также проводилось исследование содержания антител к Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculоsis.

Анализ в подгруппах

У всех обследуемых были получены диагностически значимые титры антител к Y. pseudotuberculоsis и Y. еnterocolitica в реакции агглютинации (РА). В зависимости от результатов РА пациенты с БГ были разделены на три группы: 1-я группа с титром антител к Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculоsis 1:200; 2-я группа – 1:400; 3-я группа – 1:800–1:1600.

Методы регистрации исходов

Концентрацию Т4, ТТГ в сыворотке крови определяли радиоиммунным методом с помощью наборов Immunotech (Чехия). Определение АТ к рТТГ осуществляли с помощью диагностических наборов Medipan Medizym TRAb clone (Германия).

Выявление АТ к Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica O:3, О:9 осуществляли тремя методами:

Этическая экспертиза

Проведение исследования было одобрено локальным этическим комитетом ГБУЗ Иркутская ордена “Знак Почета” областная клиническая больница г. Иркутска 4 марта 2009 г. (выписка из протокола №14).

Статистический анализ

Для статистического анализа использовалась программа Statistica 6.0 for Windows. Нормальность распределений проверялась с помощью критерия Шапиро–Уилка. Так как распределение признаков не подчинялось закону нормального распределения, в работе использовались непараметрические методы статистического анализа. Данные представлены как Ме [Q25; Q75], где Ме – медиана вариационных рядов, [Q25; Q75] – интерквартильный размах в виде 0,25 и 0,75 квартилей. Для сравнения групп исследования использовались непараметрические методы: (Манна–Уитни, c2, Краскела–Уоллиса). Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.

Определение размера выборки проводилось методом двухстороннего теста с помощью онлайн-калькулятора “Определение требуемого числа исследуемых” (http://medstatistic.ru/calculators/calcsize.html) для одной выборки при уровне значимости р = 0,05, мощность критерия составила 80%, ширина доверительного интервала – 10%. Показатель ожидаемой частоты явления в группах основывался на данных H. Tacuno и соавт. [5]. Репрезентативный размер выборки составил 67 больных БГ.

Объекты (участники) исследования

В исследовании приняли участие 78 больных БГ. Медиана возраста пациентов с БГ составила 41,5 [29,0; 49,0] лет, среди них 15 мужчин (19,2%) и 63 женщины (80,8%), мужчины и женщины по возрасту не отличались (р > 0,05). Манифестный тиреотоксикоз был диагностирован у 64 больных (82,1%), субклинический – у 14 (17,9%).

Основные результаты исследования

У больных БГ (n = 78) была проведена РА с живой вирулентной культурой Y. pseudotuberculоsis и Y. enterocolitica. У всех больных были получены диагностически значимые титры антител к Y. pseudotuberculоsis и Y. еnterocolitica: у 29 (37,2%) был обнаружен титр антител 1:200; у 40 (51,3%) – 1:400; у 9 (11,5%) – 1:800–1:1600. Первую группу составили 4 мужчин и 25 женщин, 2-ю – 8 мужчин и 32 женщины, 3-ю – 3 мужчин и 6 женщин. Группы были однородны по возрасту.

Больные БГ в зависимости от титра антител в РА были разделены на три группы:

В каждой из групп был оценен гормональный статус ЩЖ. Показатели (Me) свободного Т4 и ТТГ в группах не различались (р > 0,05). В то же время титр АТ к рТТГ у больных БГ с титром антител в РА 1:800–1:1600 был максимальным и составил 29,0 [8,7; 33,7] МЕ/мл, однако различия в группах не достигли статистической значимости. Наибольший общий объем ЩЖ, по данным УЗИ, выявлен у больных БГ с максимальным титром антител в РА (3-я группа) и составил 81,4 [67,6; 83,6] см3 (р3–1 = 0,02, р3–2 = 0,003). Объем ЩЖ у больных БГ 1-й и 2-й групп значимо не различался (р > 0,05) (табл. 1).

Таблица 1. Гормональный статус, уровень антител к рецептору ТТГ и объем щитовидной железы у пациентов с болезнью Грейвса в зависимости от титра антител в реакции агглютинации к Y. pseudotuberculоsis и Y. еnterocolitica

Примечание: р – достоверность различия показателей (метод Краскела–Уоллиса).

Анализ данных анамнеза и медицинской документации у больных БГ с разным титром антител в РА показал, что длительность течения БГ у больных 3-й группы была максимальной и составила 10,0 [7,0; 12,0] лет, во 2-й группе – 2,5 [0,5; 6,0] лет и 1-й группе – 1,5 [0,5; 6,0] лет, р1–2–3 = 0,04, р3–1 = 0,04, р3–2 = 0,01. Количество эпизодов (рецидивов) тиреотоксикоза в 3-й группе (5,0 [2,0; 10,0]) было несколько больше, чем в 1-й (1,0 [1,0; 3,0]) и во 2-й (2,0 [1,0; 3,0]) группах больных (р > 0,05).

Результаты РНГА с применением эритроцитарного диагностикума к Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica О:3 и О:9 были отрицательными у всех пациентов с БГ.

В настоящее время для лабораторного подтверждения иерсиниоза наиболее информативным считается тест на определение антител к факторам патогенности Y. еnterocolitica и Y. pseudotuberculosis методом иммуноблотинга. IgA, IgG и IgM антитела могут быть обнаружены в раннюю фазу после контакта с Y. еnterocolitica. У больных, перенесших иерсиниоз, титры IgA и IgM снижаются в течение нескольких месяцев. Антитела класса IgG обычно персистируют существенно дольше и могут выявляться в сыворотке через 12 мес и более после начального контакта с антигенами возбудителя.

Методом иммуноблотинга 30 больным БГ (всем пациентам 3-й группы, 17 из 2-й и 4 из 1-й) исследовались антитела классов IgA и IgG к факторам вирулентности патогенных штаммов Y. enterocolitica. Тест на выявление антител класса IgA в сыворотке крови больных БГ был отрицательный во всех случаях. Тест на выявление антител класса IgG к антигенам Y. enterocolitica в исследуемых сыворотках крови больных БГ из 1-й и 2-й групп был отрицательным. Но у всех больных БГ 3-й группы выявлены положительные антитела класса IgG к антигенам (белкам наружной мембраны иерсиний) YopM (Yop2a), YopH (Yop2b) – у 9 (100%) больных, V-антиген – у 9 (100%), YopD – у 8 (88,9%) больных БГ. Больные БГ с положительным и отрицательным титром антител класса IgG, определенных методом иммуноблотинга, не отличались между собой по полу, возрасту, уровням свободного Т4, ТТГ. В группе с положительными антителами IgG к факторам вирулентности патогенных штаммов Y. еnterocolitica был выше уровень АТ к рТТГ (р > 0,05), а также общий объем ЩЖ по данным УЗИ (р = 0,04) (табл. 2).

Таблица 2. Гормональный статус, уровень антител к рецептору ТТГ и объем щитовидной железы у больных болезнью Грейвса с положительным и отрицательным титром антител класса IgG к факторам вирулентности патогенных штаммов Y. enterocolitica, выявленных методом иммуноблотинга

Примечание: р – достоверность различия показателей (метод Манна–Уитни).

Длительность течения БГ у больных с отрицательным титром антител в реакции иммуноблотинга была меньше, чем с положительным (диагностическим), и составила 4,0 [1,5; 6,0] и 10,0 [7,0; 12,0] лет соответственно, р = 0,01. Количество эпизодов (рецидивов) тиреотоксикоза также было больше в группе с положительным титром антител (5,0 [2,0; 10,0] и 2,0 [1,0; 5,0]), но разница этих показателей статистически не достоверна (р > 0,05).

Нежелательные явления

Не были зарегистрированы ни у одного пациента с БГ.

Резюме основного результата исследования

У всех больных были получены диагностически значимые титры антител к Y. pseudotuberculоsis и Y. еnterocolitica в РА. Связей между титром этих антител и гормональным статусом ЩЖ не выявлено. Обнаружено, что у пациентов с максимальным титром в РА определялся больший объем ЩЖ по данным УЗИ, длительность течения БГ в этой группе была максимальной.

Результаты РНГА с применением эритроцитарного диагностикума к Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica О:3 и О:9 были отрицательными у всех обследуемых.

У всех больных БГ с максимальным титром антител в РА выявлены антитела класса IgG к белкам наружной мембраны иерсиний – V, YopM (Yop2a), YopH (Yop2b), YopD методом иммуноблотинга.

Обсуждение основного результата исследования

Положительные результаты РА и иммуноблотинга ставят вопрос: страдали ли обследуемые больные БГ кишечным иерсиниозом или псевдотуберкулезом и имели ли его в анамнезе? Отсутствие перенесенной иерсиниозной инфекции у обследованных больных БГ подтвердили отрицательные клинико-анамнестические данные и негативные результаты исследования сывороток в РНГА с применением эритроцитарного диагностикума к Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica О:3 и О:9. Диагностикум предназначен для выявления антител к липополисахариду иерсиний в сыворотке крови людей и не дает перекрестных реакций на антитела к белковым детерминантам.

Антитела класса IgG к белкам, экспрессируемым родоспецифической плазмидой “вирулентности” pYV Y. enterocolitica, выявлены только у обследуемых с максимальным титром антител в РА. Тест на выявление антител класса IgA был негативным у всех пациентов с БГ, что также не подтверждает наличие иерсиниозной инфекции. Положительные результаты, выявленные в РА и методом иммуноблотинга, объясняются выработкой перекрестно-реагирующих антител к белкам наружной мембраны иерсиний у пациентов с БГ. У патогенныхиерсиний на наружной мембране имеются плазмидкодированные “ТТГ-рецептороподобные белки”, структурно идентичные участкам рТТГ тироцитов человека. Именно с ними могут вступать во взаимодействие АТ к рТТГ у больных БГ, обладающие перекрестной реактивностью, вследствие структурной генетической схожести [13]. Отсутствие связи между титром выявленных антител к иерсиниям и уровнями тиреоидных гормонов, АТ к рТТГ тироцитов, а также негативные результаты РНГА отрицают триггерную роль иерсиний в развитии БГ.

Ранее в проспективном исследовании, проведенном Л.Ю. Хамнуевой и соавт., не показана роль Y. рseudotuberculоsis как инициирующего фактора развития БГ [15]. Было оценено состояние ЩЖ у больных, перенесших псевдотуберкулез. Обследование пациентов в острой стадии в фазу реконвалесценции (n = 21) не выявило характерных для гипотиреоза или тиреотоксикоза клинических симптомов, ультразвуковая картина, данные объективного осмотра и пальпации ЩЖ не имели специфических отличий от здоровых лиц. Основываясь на публикациях о возможной триггерной роли иерсиний в развитии БГ, целенаправленно искали характерную для тиреотоксикоза клиническую симптоматику, при объективном осмотре тщательно анализировали показатели гормонального статуса у каждого больного. При обследовании больных в течение года после перенесенного псевдотуберкулеза (n = 44) ни в одном случае не зарегистрирована БГ. С этим данными согласуются результаты исследования G. Effraimidis и соавт. [16], которые показали отсутствие связи между инфицированием Y. enteroсоlitiсa и развитием аутоиммунных заболеваний ЩЖ. Хотя возможность развития аутоиммунных заболеваний на основе перекрестно-реагирующих антигенов доказана В.В. Серовым и О.В. Зайратьянц, обращает внимание то, что обычно такие антигены обусловливают продукцию нецитотоксических антител и не ведут к повреждению тканей [17].

Ограничения исследования

В качестве основного ограничения исследования следует указать то, что в исследование не вошли пациенты с компенсированным тиреотоксикозом и в фазе ремиссии, поэтому полученные данные можно экстраполировать только на пациентов БГ с манифестным и субклиническим тиреотоксикозом.

В сыворотке крови больных БГ в РА и методом иммуноблотинга определяются перекрестно-реагирующие антитела к антигенам наружной мембраны Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculоsis. Диагностический титр данных антител чаще выявляется у пациентов с боольшейдлительностью БГ, значительным объемом ЩЖ.

Отсутствие связи между титром данных антител и уровнями тиреоидных гормонов, АТ к рТТГ, а также негативные результаты в РНГА с диагностикумом, не содержащим белков наружной мембраны патогенных иерсиний, отрицают триггерную роль иерсиниозной инфекции как инициирующего фактора развития БГ.

Источник финансирования. Работа проведена при поддержке ФГБОУ ВО Иркутский государственный медицинский университет Минздрава России, ФКГУЗ Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора в рамках совместной научной работы.

Конфликт интересов. Все авторы заявляют об отсутствии потенциальных и явных конфликтов (двойственности) интересов, связанных с публикацией данной статьи.

Информация о вкладе каждого автора: Хамнуева Л.Ю. – концепция и дизайн исследования, сбор информации, анализ полученных данных, написание и редактирование текста; Гома Т.В. – сбор информации, сбор и обработка материалов, анализ полученных данных, написание текста; Климов В.Т. – сбор информации, проведение лабораторной диагностики, анализ полученных данных, редактирование текста.