Изучить частоту моногенных форм тяжелого врожденного гипотиреоза вследствие мутаций в генах TSHR, PAX8, FOXE1, NKX2-1, NKX2-5.

Дизайн исследования

Проведено обсервационное многоцентровое одномоментное выборочное неконтролируемое исследование с участием пациентов с тяжелым врожденным гипотиреозом.

Критерии соответствия

Критерием включения в исследование было повышение уровня тиреотропного гормона (ТТГ) по данным неонатального скрининга или ретестирования более 90 мМЕ/л. Неонатальный скрининг был проведен всем пациентам по месту жительства в соответствии с приказом Минздравсоцразвития РФ от 22.03.2006 №185 “О массовом обследовании новорожденных детей на наследственные заболевания”.

Критерием исключения из исследования было увеличение размеров щитовидной железы (ВОЗ, 2003) по данным неонатального скрининга.

Условия проведения

Первичное обследование и набор пациентов были проведены на следующих базах: ФГБУ “Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии” Минздрава России (Москва), ГБУЗ РБ “Республиканская детская клиническая больница” (Уфа), ГБУЗ СО “Областная детская клиническая больница №1” (Екатеринбург).

Продолжительность исследования

Набор пациентов проводился в период с ноября 2014 г. по сентябрь 2016 г.

Исходы исследования

В ходе проведения молекулярно-генетического исследования оценивались наличие и частота обнаружения мутаций в генах TSHR, NKX2-1, NKX2-5, PAX8, FOXE1.

Методы регистрации исходов

Молекулярно-генетический анализ проводился в лаборатории отделения наследственных эндокринопатий ФГБУ “НМИЦ эндокринологии” Минздрава России. Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферический крови стандартным методом (набор Pure Link, Genomic DNA Mini Kit, Life Technologies, США). Для молекулярно-генетического анализа применялся метод NGS. Использовалась разработанная в отделении наследственных эндокринопатий ФГБУ “НМИЦ эндокринологии” Минздрава России панель праймеров для мультиплексной ПЦР и секвенирования с применением технологии Ion Ampliseq™ Custom DNA Panel (Life Technologies, США). Панель праймеров “Гипотиреоз” охватывает кодирующие области следующих генов: TPO, PAX8, NKX2-5, IYD, SLC26A4, TG, GLIS3, FOXE1, NKX2-1, DUOX2, DUOX1, DOUXA2, TSHR, SLC5A5, TSHB, THRB, THR, UBR1, THRA, SLC16A2. Подготовка библиотек и эмульсионная ПЦР проводились в соответствии с рекомендациями производителя. Секвенирование осуществлялось на полупроводниковом секвенаторе PGM (Ion Torrent, Life Technologies, США). Биоинформатическая обработка результатов секвенирования проводилась с помощью программного модуля Torrent Suite 4.2.1 (Ion Torrent, Life Technologies, США) и пакета программ Annovar (версия 2014Nov12) [8]. После анализа полученных данных проводилось подтверждение полученных мутаций на секвенаторе Genetic Analyzer Model 3130 (Life Technologies, США). В качестве референсных последовательностей генов использовались ссылки Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Интерпретация результатов исследований и оценка патогенности нуклеотидных изменений проводились согласно международным рекомендациям [9]. Обозначение мутаций проведено в соответствии с рекомендациями den Dunnen и Antonarakis [10].

Одному пациенту с подозрением на обширную делецию в гене PAX8 по результатам анализа покрытия NGS и пациентам с одной гетерозиготной мутацией в гене TSHR (n = 3) проведена мультиплексная амплификация лигазо-связанных проб (multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA). При этом использовался набор зондов SALSA MLPA probemix P319, включающих последовательность генов TPO, PAX8, FOXE1, NKX2-1, TSHR (MRC-Holland, Нидерланды), и стандартный набор реагентов SALSA MLPA EK1–FAM (MRC-Holland, Нидерланды). Обработка полученных данных проведена с использованием программного обеспечения Coffalyser.Net (MRC-Holland, Нидерланды).

Этическая экспертиза

Данное исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ “НМИЦ эндокринологии” Минздрава России (протокол №12 от 22.10.2014). Информированное согласие было получено от всех обследованных пациентов; если возраст обследованных не достиг 15 лет, информированное согласие было подписано законным представителем в соответствии с протоколом исследования.

Статистический анализ

Размер выборки участников предварительно не рассчитывался. Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ Exel Microsoft Office 2013 и STATISTICA 10.0 (StatSoftInc., USA, Version 10.0). Для количественных признаков рассчитывались медианы (Me), перцентили [25; 75].

Объекты (участники) исследования

В исследование был включен 161 пациент с диагнозом “врожденный гипотиреоз” (ТТГ более 90 мМЕ/л).

Медиана возраста пациентов на момент проведения исследования составила 5,1 года [2,9; 10,8], самому младшему пациенту было 2 нед, старшему – 17 лет 11 мес. Распределение по полу было следующим: 97 девочек (60,25%) и 64 мальчика (39,75%).

В ходе проведения ультразвукового исследования щитовидной железы получены следующие результаты: щитовидная железа нормального объема выявлена у 23 пациентов, гипоплазия – у 97, эктопия органа – у 10 и полная аплазия – у 31 обследуемого.

Основные результаты исследования

По результатам проведенного молекулярно-генетического исследования мутации в гене TSHR были выявлены у 6 пациентов (3,73%, 6/161), NKX2-1 – у 3 обследуемых (1,86%, 3/161), NKX2-5 – у 1 (0,62%, 1/161), PAX8 – у 3 (1,86%, 3/161) (таблица). Мутации в гене FOXE1 обнаружены не были.

В нашем исследовании компаунд-гетерозиготная мутация в гене TSHR выявлена у одного пациента (N4), у двух сибсов от близкородственного брака (N1-1 и N1-2) выявлена гомозиготная мутация, трое пациентов (N2, N3-1, N3-2) имели по одной гетерозиготной мутации (таблица). Пациентам из последней группы (N2, N3-1, N3-2) проведено дополнительное генетическое исследование методом мультиплексной амплификации лигазо-связанных проб, однако патологических изменений выявлено не было.

Среди идентифицированных нами нуклеотидных изменений ранее описанной оказалась только миссенс-мутация c.C484G p.P162A (замена пролина на аланин в положении 162) [11]. По результатам функционального исследования выявлено, что для стимуляции мутантного рецептора требуется значительное повышение уровня ТТГ (в 20 раз) по сравнению с нормой [11].

Клинически у пациентов с мутациями в TSHR выявлены уменьшенные или нормальные размеры ЩЖ, что согласуется с патогенезом заболевания (таблица). У двух сибсов с гомозиготной мутацией p.I47fs обнаружена аплазия ЩЖ, что вероятно связано с полной утратой рецептором функциональной активности.

Различные нуклеотидные изменения в гене NKX2-1 выявлены у 3 пациентов: 2 делеции со сдвигом рамки считывания, которые были классифицированы как патогенные, и 1 миссенс-мутация с неопределенной патогенностью (таблица, подробное описание клинического случая N5 было представлено нами ранее [12]). Все нуклеотидные изменения выявлены в гетерозиготном состоянии, что согласуется с аутосомно-доминантным типом наследования, характерным для данного заболевания [13]. У пациентов N5 и N7 помимо ВГ были диагностированы дополнительные компоненты синдрома. С первых месяцев жизни у пациента N5 выявлена мышечная гипотония, задержка моторного развития, в возрасте 15 мес появились гиперкинезы ног. У пациента N7 выявлен наиболее тяжелый вариант заболевания. При рождении отмечалась нарастающая дыхательная недостаточность, потребовавшая перевода ребенка на искусственную вентиляцию легких (снят в возрасте 1 мес), диагностирована внутриутробная правосторонняя очагово-сливная пневмония. При осмотре в возрасте 7 мес обращает на себя внимание общая мышечная гипотония, гиперкинезы не выявлены.

У трех пациентов были идентифицированы мутации в гене PAX8 (таблица): 2 миссенс-мутации с неопределенной патогенностью и 1 обширная делеция. Среди данных пациентов особый интерес представляет обследуемый N11. В ходе анализа результатов высокопроизводительного параллельного секвенирования была заподозрена обширная делеция гена, что и было доказано методом MLPA (рисунок). По данным ультразвукового исследования у всех пациентов из данной группы выявлена гипоплазия ЩЖ, которая является характерным проявлением дефектов в гене PAX8 [14].

Результаты MLPA у пациента N11.

В данном исследовании выявлена 1 гетерозиготная миссенс-мутация в гене NKX2-5 (таблица), отнесенная к вариантам с неопределенной патогенностью, пороков развития сердца у данного пациента не обнаружено.

Резюме основного результата исследования

В нашем исследовании был проведен анализ генов-кандидатов, мутации в которых приводят к развитию различных нарушений органогенеза ЩЖ (TSHR, PAX8, FOXE1, NKX2-1, NKX2-5), на выборке из 161 пациента из Российской Федерации. Полученные нами результаты подтвердили, что мутации в генах дисгенеза являются крайне редкой патологией, что согласуется с данными мировой литературы [15, 16].

Обсуждение основного результата исследования

Первые масштабные исследования по изучению этиологии врожденного гипотиреоза и распространенности различных форм заболевания были основаны на методах визуализации [1, 2, 17]. При этом ВГ, обусловленный дисгенезией органа, выявлен у 80–85% пациентов, остальные 15–20% случаев были обусловлены дисгормоногенезом и сопряжены с увеличением размеров ЩЖ [1, 2, 17]. Полученные данные позволили предположить, что основной причиной развития ВГ являются мутации в генах-кандидатах, ответственных за эмбриогенез щитовидной железы. Последующие исследования были направлены на подтверждение данной гипотезы [15, 16]. Однако молекулярная основа была установлена менее чем у 6% обследуемых [15, 16].

Инактивирующие мутации TSHR приводят к широкому фенотипическому спектру, от тяжелого врожденного гипотиреоза до изолированного повышения уровня ТТГ. Чувствительность тканей щитовидной железы к стимулирующему действию ТТГ может полностью отсутствовать, что приводит к нарушению роста органа [11, 18]. Степень резистентности к ТТГ зависит от типа мутации и количества мутировавших аллелей [18]. Тяжелый врожденный гипотиреоз с гипоплазией ЩЖ, как правило, встречается при биаллельных мутациях, в то время как моноаллельные изменения приводят к мягким формам заболевания [18]. Однако фенотипическая вариабельность является характерной чертой мутаций гена TSHR, в том числе описаны случаи гипоплазии железы при гетерозиготных изменениях [18]. К настоящему моменту в гене TSHR выявлено более 60 инактивирующих мутаций, приводящих к развитию синдрома резистентности к ТТГ [18]. Мутации распределены по всей длине гена, за исключением интрацеллюлярной С-концевой области [18]. В нашем исследовании различные нуклеотидные изменения в гене TSHR выявлены у 6 обследуемых, в том чисел у 2 пар сибсов. Интересно, что у пациентов N2, N3-1, N3-2 было обнаружено только по 1 гетерозиготной миссенс-мутации, несмотря на наличие у них тяжелого ВГ. Мутация p.C301Y представляет собой замену цистеина на тирозин в области цистеин-богатых доменов, что должно приводить к нарушению связывания с лигандом и, возможно, к дезорганизации третичной структуры белка. Миссенс-мутация c.C484G p.P162A (пациент N2) была ранее исследована, ее патологическая значимость доказана in vitro [11].

В гене NKX2-1 описано более 70 мутаций [5], которые приводят к развитию синдрома “мозг – легкие – щитовидная железа”, классическими проявлениями которого являются доброкачественная наследственная хорея, гипотиреоз и респираторный дистресс-синдром [13]. Однако совокупность всех трех симптомов данного заболевания встречается только в 50% случаев и чаще всего обусловлена наличием таких мутаций, как инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания [13]. В нашей когорте наиболее тяжелое течение заболевания также отмечалось именно у пациентов с обширными делециями гена NKX2-1.

Кодируемый геном PAX8 белок является транскрипционным фактором, принадлежащим к семейству PAX, отличительной чертой которого является наличие консервативного ДНК-связывающего домена (paired box domain) [19]. Существует описание более 20 инактивирующих мутаций в данном гене, большинство из которых локализовано в ДНК-связывающем домене [19]. В проведенном нами исследовании выявлена мутация c.G440A p.C147Y, локализованная в экзоне 5, кодирующем фрагмент белка между ДНК-связывающим доменом и консервативным октапептидом [20]. Ранее мутации в этой части PAX8 идентифицированы не были, в связи с чем влияние данного изменения на функцию белка не определено [20]. Миссенс-мутация c.A701G p.E234G расположена в центральном гомеодомене, должна приводить к снижению транскрипционной активности [20].

Относительно роли белка NKX2-5 в процессах развития и функционирования щитовидной железы к настоящему моменту остается большое количество вопросов. Известно лишь о наличии экспрессии NKX2-5 в зачатке щитовидной железы во время эмбриогенеза [6], в связи с чем мутации в этом гене и были предложены как новый механизм формирования дисгенезии щитовидной железы [7]. После выдвижения данной теории M. Dentice и соавт. провели скрининг группы пациентов с различными вариантами дисгенезии ЩЖ и врожденным гипотиреозом на наличие мутаций в гене NKX2-5, в результате чего у четырех обследуемых были идентифицированы 3 различные миссенс-мутации в гетерозиготном состоянии [7]. При ультразвуковом исследовании у троих пациентов выявлена эктопия, у одного – аплазия ЩЖ, незначительные нарушения со стороны сердечно-сосудистой системы обнаружены только у одного пациента [7]. Функциональные исследования в ходе данной работы были проведены для всех мутаций, при этом отмечалось снижение активации промотеров генов TG, TPO и DUOX2 [7]. Несмотря на полученные результаты, патогенность изменений вызывает сомнения по ряду причин. Во-первых, аналогичные мутации были выявлены у здоровых родителей, во-вторых, одна из мутаций идентифицирована у одного обследуемого из группы контроля [7]. Авторы исследования объясняют это различной степенью пенетрантности и вариабельной экспрессией гена на уровне тканей ЩЖ и сердца [7]. Между тем на сегодняшний день в мировой литературе не представлено весомых доказательств выдвинутых гипотез.

Мутации гена FOXE1 сопровождаются формированием классического симптомокомплекса: врожденный гипотиреоз, аплазия ЩЖ, расщелина неба, двусторонняя атрезия хоан, раздвоенный надгортанник и “стоящие торчком” волосы, получившего название синдром Бамфорта–Лазаруса [21, 22]. К настоящему моменту в гене FOXE1 зарегистрировано всего 6 миссенс-мутаций, все расположены в ДНК-связывающем домене [5, 22]. У пациентов из нашей когорты мутации в гене FOXE1 обнаружены не были, что было ожидаемо, так как ни у одного пациента не выявлено классических проявлений синдрома.

Ограничения исследования

Идентификация у наших пациентов ранее не описанных нуклеотидных изменений требует проведения функциональных исследований in vivo или in vitro с целью уточнения влияния данных мутаций на функциональную активность белка. Несмотря на то что эти исследования в нашей работе проведены не были, обнаруженные мутации имеют высокую вероятность патогенности по результатам прогнозирования in silico.

Проведенное нами исследование подтвердило низкую частоту встречаемости мутаций в генах TSHR, PAX8, FOXE1, NKX2-1, NKX2-5. Тем не менее всем детям с диагнозом “врожденный гипотиреоз” рекомендуется проведение молекулярно-генетического исследования, что в ряде случаев позволит определить оптимальную тактику наблюдения и ведения пациентов, а в дальнейшем провести генетическое консультирование по вопросам дальнейшего планирования семьи.

Источник финансирования. Работа выполнена при содействии Фонда поддержки и развития филантропии “КАФ”.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.