Экспрессия гликопротеина-­P при экспериментальной дисфункции щитовидной железы

Введение

Гликопротеин-P (Pgp), или АВСВ1-белок, – это АТФ-зависимый белок-транспортер, который экспрессируется в цитоплазматической мембране эпителия проксимальных почечных канальцев, гепатоцитов, энтероцитов, эндотелия гистогематических барьеров, а также опухолевых клеток. Для многих лекарственных препаратов – субстратов Pgp (например, дигоксин, фексофенадин, дабигатрана этексилат, ряд цитостатиков и др.) он является основным фактором, определяющим их фармакокинетику, в частности всасывание, распределение (проникновение через гистогематические барьеры) и выведение из организма. Физиологическая роль белка-транспортера определяется участием в переносе ряда эндогенных- веществ, например глюкокортикосте-роидов, альдостерона, цитокинов.

Активность Pgp подвержена значительным колебаниям как в результате генетических особенностей организма, так и вследствие воздейcтвия на него различных- факторов внешней и внутренней среды (лекарственных средств, гипоксии, ацидоза и др.). При этом индукция функционирования белка-транспортера может привести к неэффективности фармакотерапии и развитию ряда патологических состояний, таких как множественная лекарственная устойчивость опухолей, а ингибирование – к относительной передозировке лекарственных веществ [1, 2].

Ранее нами было показано, что тиреоидные гормоны влияют на функциональную активность Pgp на уровне целостного организма, определяемую по фармакокинетике его маркерного субстрата – фексофенадина. В частности, развитие эксперименталь-ного гипотиреоза приводит к снижению функциональной активности белка-транспортера, а моделирование гипертиреоза – к ее повышению [3, 4]. Однако остается открытым вопрос, за счет каких механизмов изменяется активность Pgp при экспериментальной дисфункции щитовидной железы.

Цель

Поскольку изменение экспрессии изучаемого белка-транспортера считается ведущим механизмом модуляции его функциональной активности [1], целью настоящего исследования явилось изучение экспрессии Pgp в органах и тканях при экспериментальном гипо- и гипертиреозе.

Материал и методы

Работа выполнена на 54 половозрелых кроликах-самках породы Шиншилла массой 3500–4300 г, находящихся в фазе диэструса, полученных из питомника ООО “Касимов-Миакро” и имеющих необ-ходимые ветеринарные свидетельства. Экспери-мен-тальные исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (Приложение к приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23.08.2010 № 708н).

Все животные были разделены на 4 группы. Первая группа – интактные животные (контроль). Вторая группа – кролики с экспериментальным гипер-тиреозом, моделируемым введением тироксина (L-тироксин, Berlin Chemie Menarini) в дозе 100 мкг/кг массы подкожно в течение 1, 7 и 14 дней [3]. Третья группа – животные с экспериментальным гипотиреозом на фоне субтотальной резекции щитовидной железы с оставлением паращитовидных желез на 7, 14 и 21-е сутки после оперативного вмешательства. Операцию выполняли в условиях операционной после наркотизации животных введением ксилазина гидрохлорида (Рометар, Bioveta) в дозе 4–6 мг/кг массы внутримышечно (в/м) с последующим (через 20 мин) внутримышечным введением золетила-50 (125 мг тилетамина гидрохлорида и 125 мг золазепама гидрохлорида, Virbac) в дозе 5–10 мг/кг массы [5]. Четвертая группа – кролики с экспериментальным гипотиреозом, моделируемым курсовым введением тиамазола (Мерказолил, “Акрихин”) в дозе 5 мг/кг массы per os на 21-е сутки введения и на 5-й день отмены препарата [4].

В каждой временной точке исследовали по 6 животных. У кроликов проводили забор крови из краевой вены уха в объеме 5 мл для определения сывороточных уровней гормонов: общего тироксина (Т₄), общего трийодтиронина (Т₃), тиреотропного гормона (ТТГ). Исследование концентраций гормонов осуществляли в ЦНИЛ РязгМУ Минздрава России радиоиммунным методом с применением стандартной тест-системы производства IMMUNOTECH (Чехия), с дальнейшей обработкой полученных результатов на анализаторе “Иммунотест” (Москва).

Далее животных выводили из эксперимента методом- воздушной эмболии. Для исследования из одного участка органов забирали ткани печени, почки, тощей кишки и коры больших полушарий мозга (выбор тканей определялся локализацией Pgp). Гистологический материал фиксировали в 10%-ном растворе забуференного нейтрального формалина, обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации, просветляли ксилолом и заключали в парафин.

Перед реакцией иммунного окрашивания производили демаскировку антигенов тканей посредством нагревания на водяной бане в 10 мМ цитратном буфере (рН 6,0), блокировали эндогенную пероксидазу 3%-ным раствором пероксида водорода. Затем инкубировали срезы с первичными антителами к Pgp (Mdr-1 3H2833: sc-71557, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC, США) в разведении 1:50 по стандартной методике. Для иммунного окрашивания использовали полимерную систему детекции с пероксидазной меткой (DAKO, Дания). Ядра клеток докрашивали гематоксилином.

Микропрепарат фотографировали с помощью цифровой камеры “ЛОМО ТС-500” при увеличении в 400 раз. В каждом гистологическом препарате оценивали 10 репрезентативных участков (10 фотографий). В дальнейшем изображения анализировали с помощью медицинской программы для анализа и обработки цифровых изображений Image J. С помощью плагина Colour Deconvolution, имеющего встроенную схему для анализа окраски “гематоксилин + диаминобензидин”, изображение разделяли на синий и коричневый цвет. Интенсивность окраски “диаминобензидина” на фотографиях почек и кишечника оценивали с использованием модуля “гистограмма” в диапазоне от 0 (черное) до 255 (белое), а затем переводили полученные значения в “+”: 255–200 – “+”, 200–150 – “++”, менее 150 – “+++” [6]. В печени и коре больших полушарий определяли относительную площадь мембран, экспрессирующих Pgp, которая рассчитывалась автоматически как площадь мембран, экспрессирующих Pgp (pix2)/ общая площадь поля зрения (pix2).

Полученные результаты обрабатывали с помощью программ StatSoft Statistica 7.0 и “Биостат”. Характер распределения данных оценивали по критерию Шапиро–Уилка. Для сравнения показателей, имеющих нормальное распределение, использовали тест ANOVA, а при распределении признаков, отличном от нормального, – критерий Крускала–Уоллиса. Различия между сериями определяли по критерию Ньюмена–Кейсла. Для анализа корреляции между гормональным статусом кроликов и экспрессией Pgp использовали коэффициент корреляции Спирмена или Пирсона в зависимости от распределения данных. Результаты в таблицах представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения среднего арифметического (M ± SD) в случае их нормального распределения и в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Med, lq, uq) – в случае отличного от нормального распределения данных.

Результаты и их обсуждение

Подкожное введение кроликам тироксина в дозе 100 мкг/кг массы сопровождалось развитием экспериментального гипертиреоза, о чем свидетельствуют достоверное повышение сывороточного уровня Т₄ на 47,3% (p < 0,05) на 1-е сутки эксперимента; увеличение концентраций Т₃ на 157,8% (p < 0,05), Т₄ – на 132,9% (p < 0,05) на 7-й день исследования; снижение содержания ТТГ на 31,7% (p < 0,05), повышение уровней Т₃ и Т₄ на 270,1 и 172,1% (p < 0,05) соответственно на 14-й день патологии по сравнению с данными у интактных животных (табл. 1).

Резекция щитовидной железы у кроликов приводила к развитию экспериментального гипотиреоза, что проявлялось повышением уровня ТТГ в сыворотке крови на 7-е сутки после операции на 34,9% (p < 0,05), на 14-е сутки – на 42,9% (p < 0,05), на 21-е сутки – на 49,2% (p < 0,05); снижением концентраций Т₃ и Т₄ на 7-й день на 51,9 и 74,5% (p < 0,05), на 14-е сутки – на 52,9 и 77,7% (p < 0,05) соответственно; на 21-е сутки – уменьшением содержания Т₄ на 75,9% (p < 0,05) по сравнению с группой контроля (табл. 1).

Пероральное введение тиамазола кроликам в дозе 5 мг/кг массы в течение 21 дня также сопровождалось снижением функции щитовидной железы: наблюдалось повышение сывороточного уровня ТТГ на 39,7% (p < 0,05) и уменьшение концентрации Т₄ на 71,9% (p < 0,05). Аналогичные изменения регистрировались и на 5-й день отмены антитиреоидного препарата: содержание ТТГ увеличивалось на 41,2% (p < 0,05), уровень Т₄ уменьшался на 65,6% (p < 0,05) по сравнению с серией контроля (табл. 1).

При изучении экспрессии Pgp в печени на фоне экспериментального гипо- и гипертиреоза в сравнении с интактными животными были получены следующие результаты. Однократное применение тироксина не приводило к изменению экспрессии белка-транспортера, однако 7- и 14-дневный курсы введения препарата сопровождались достоверным повышением экспрессии Pgp в печени на 38,7% (p < 0,05) и 28,9% (p < 0,05) соответственно. На фоне резекции щитовидной железы экспрессия изучаемого белка-транспортера в печени снижалась на 14-е сутки после оперативного вмешательства на 34,7% (p < 0,05), а на 21-й день – на 45,4% (p < 0,05). После введения тиамазола курсом 21 день отмечалось снижение экспрессии Pgp на 54,6% (p < 0,05), на 5-й день отмены тиреостатика – на 47,6% (p < 0,05) (табл. 2).

В коре больших полушарий головного мозга отмечались следующие изменения экспрессии Pgp на фоне экспериментальной дисфункции щитовидной железы по сравнению с группой контроля: при введении тироксина в течение 14 дней наблюдалось повышение экспрессии белка-транспортера на 32,3% (p < 0,05), резекция щитовидной железы приводила к снижению экспрессии Pgp на 14-е и 21-е сутки после операции – на 31,6 и 26,6% (p < 0,05) соответственно; а применение тиамазола вызывало уменьшение экспрессии Pgp на 36,7% (p < 0,05) лишь на 5-й день отмены тиреостатика после его курсового введения (табл. 2).

Экспрессия Pgp в тощей кишке по сравнению с серией интактных кроликов увеличивалась после введения тироксина в течение 14 дней на 18,1% (p < 0,05), уменьшалась на 7-е и 21-е сутки после резекции щитовидной железы на 19,2 и 19,8% (p < 0,05) соответственно, а на 21-е сутки введения тиамазола и на 5-й день его отмены снижалась на 23,7 и 21,5% (p < 0,05) (табл. 2).

На фоне введения тироксина экспрессия Pgp в почках достоверно не изменялась. Развитие экспериментального гипотиреоза после резекции щитовидной железы приводило к снижению экспрессии белка-транспортера в почках на 7-е сутки на 19,1% (p < 0,05), на 14-е сутки – на 18,5% (p < 0,05) по сравнению с группой контроля. Применение тиамазола также сопровождалось достоверным уменьшением экспрессии Pgp в почках на 21-й день введения препарата на 17,8% (p < 0,05) (табл. 2).

При изучении зависимости экспрессии Pgp от гормонального статуса кроликов была выявлена прямо пропорциональная связь между экспрессией белка-транспортера и концентрациями Т₃ и Т₄ в сыворотке крови и обратно пропорциональная связь с уровнем ТТГ во всех исследуемых органах (табл. 3).

Таким образом, при гипертиреозе, моделируемом подкожным введением тироксина у кроликов, отмечалось повышение экспрессии Pgp в печени на 7-е сутки; в печени, тощей кишке и коре больших полушарий мозга – на 14-е сутки экспериментальной патологии. В почках экспрессия белка-транспортера достоверно не изменялась.

Согласно современным представлениям индуцированная экспрессия Pgp в нормальных и трансформированных клетках преимущественно регулируется областью промотора гена MDR1, кодирующего данный- белок-транспортер [7]. Большинство внутриклеточных стимулов, активирующих экспрессию, сходятся в данном месте. Тиреоидные гормоны, предположительно, могут индуцировать экспрессию Pgp, связываясь с промотором гена MDR1 напрямую или опосредованно через прегнан-Х-рецептор [8], а также увеличивая экспрессию транскрипционных факторов, повышающих синтез Pgp (например, фактора, индуцируемого гипоксией HIF-1a) [9, 10].

При моделировании хирургического гипотире-оза было выявлено снижении экспрессии Pgp в печени и головном мозге на 14-е и 21-е сутки, в тощей кишке – на 7-е и 21-е сутки, в почках – на 7-й и 14-й дни после субтотальной резекции щитовидной железы.

Аналогичные результаты были получены при моделировании медикаментозного гипотиреоза введением антитиреоидного препарата – тиамазола. Так, экспрессия Pgp в печени и тощей кишке снижалась на 21-е сутки введения тиреостатика и на 5-й день его отмены, в мозге – на 5-е сутки отмены, а в почках – на 21-й день введения препарата.

Большинство эффектов тиреоидных гормонов реализуется в результате взаимодействия Т₃ и Т₄ со специфическими ядерными рецепторами. При этом рецепторы тиреоидных гормонов всегда связаны с участками ДНК – “тиреоидчувствительными элементами” (thyroid response elements). В отсутствие гормонов соответствующие рецепторы ингибируют экспрессию генов, а при наличии тиреоидных гормонов блок снимается [11]. Видимо, снижение концентрации Т₃, Т₄, выявленное в настоящем исследовании, приводило к уменьшению экспрессии белка-транспортера по данному механизму. Наличие корреляции между концентрацией гормонов и экспрессией Pgp, показанное в данной работе, подтверждает выдвинутую гипотезу.

Полученные результаты согласуются с рядом исследований, выполненных на других экспериментальных животных. Например, на крысах Вистар при гипертиреозе выявлено существенное повышение экспрессии Рgp в печени и почках, умеренное – в тощей и подвздошной кишке [12].

Таким образом, тиреоидные гормоны являются тканеспецифичными индукторами экспрессии Pgp, однако механизмы индуцирующего влияния требуют более детального изучения.

Выводы

1. Экспериментальный гипертиреоз у кроликов, моделируемый подкожным введением тироксина в дозе 100 мкг/кг массы в течение 14 дней, вызывает повышение экспрессии гликопротеина-P в печени, тощей кишке и коре больших полушарий головного мозга.

2. Экспериментальный гипотиреоз у кроликов, моделируемый резекцией щитовидной железы или введением тиамазола в дозе 5 мг/кг массы в течение 21 дня, приводит к снижению экспрессии глико-протеина-P в печени, почках, тощей кишке и коре больших полушарий головного мозга.

3. Выявлены корреляционные зависимости между уровнями общего Т₄, общего Т₃, ТТГ в сыворотке крови и экспрессией гликопротеина-P в печени, почках, тощей кишке и коре больших полушарий головного мозга.

Информация о конфликте интересов

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.