Влияние полиморфизма Ser38Gly гена β-субъединицы калиевого канала миокарда на течение тиреотоксической кардиомиопатии у пациентов с болезнью Грейвса

Тиреотоксическая кардиомиопатия (ТКМП) – одно из самых тяжелых, далеко не всегда обратимых осложнений тиреотоксикоза, часто определяющее прогноз пациента. Факторы риска формирования и дальнейшего прогрессирования этого осложнения в настоящее время остаются не до конца ясными. При этом при болезни Грейвса, одной из самых частых причин тиреотоксикоза, очень важно в дебюте заболевания, до развития осложнений, отобрать лиц, требующих раннего радикального лечения. У этих пациентов рецидив тиреотоксикоза значимо повышает риск развития тяжелых проявлений ТКМП. Возраст, пол, длительность тиреотоксикоза и наличие сопутствующей патологии сердечно-сосудистой системы безусловно являются факторами риска поражения миокарда [1–3], однако они не всегда коррелируют с тяжестью ТКМП [4]. Учитывая большое внимание, которое уделяется в настоящее время роли генетических факторов в этиологии и патогенезе различных патологических состояний, в том числе и мультифакториальных болезней, среди возможных предикторов ТКМП рассматриваются однонуклеотидные полиморфизмы.

Мы предположили, что при тиреотоксикозе значительное влияние могут оказать мутации в генах, экспрессия которых изменяется под действием гормонов щитовидной железы. Среди этих генов наибольший интерес для нас представляли те из них, которые либо влияют на сократимость миокарда, либо изменяют ионные токи в кардиомиоцитах, тем самым способствуя аритмогенезу. Кроме того, однонуклеотидные полиморфизмы, которые мы выбирали для изучения, по данным литературы, участвовали в патогенезе нетиреотоксической кардиальной патологии, например, были ассоциированы с фибрилляцией предсердий. Мы предполагали, что они будут влиять и на развитие фибрилляции предсердий, обусловленной тиреотоксикозом. Интерес именно к фибрилляции предсердий обусловлен тем, что она является одним из самых частых и опасных проявлений ТКМП, зачастую определяет прогноз пациентов с тиреотоксикозом. Частота фибрилляции предсердий при тиреотоксикозе варьирует от 7–8% среди пациентов среднего возраста до 10–20% среди пациентов пожилого возраста и 20–35% при наличии таких сопутствующих заболеваний, как ишемическая болезнь сердца и пороки клапанов [5–7].

В наших более ранних работах было продемонстрировано влияние мутаций в генах дейодиназы 2-го типа и â1-адренорецепторов на течение ТКМП [6–9].

Целью настоящего исследования было изучение влияния полиморфизма rs1805127 в гене KCNE1. Этот полиморфизм характеризуется нуклеотидной заменой аденина на гуанин в 112-м кодоне, что приводит к замещению серина глицином в положении 38 [10]. Ген KCNE1 кодирует вспомогательную мембранную â-субъединицу потенциал-зависимых калиевых каналов миокарда – minimal K⁺ channel peptide (minK). Белок minK вместе с другими белками семейства KCNE регулирует свойства основных поро-образующих субъединиц (a-субъединиц) потенциал-зависимых калиевых каналов [11]. Мутации в генах этих белков могут оказывать существенное влияние на риск развития предсердных аритмий, типичных для тиреотоксикоза [12]. MinK представляет собой один трансмембранный домен, состоящий из 130 аминокислот, он может соединяться с a-субъединицами каналов Kv7.1 и Kv2.1 и формировать медленно активирующийся калиевый ток задержанного выпрямления (I_Ks) [13, 14]. При этом чувствительность калиевых каналов к изменениям объема клетки уменьшается. Все известные мутации в гене minK приводят к уменьшению калиевых токов, продлению потенциала действия в кардиомиоцитах и увеличению интервала QT на электрокардиограмме [15, 16]. Результаты исследования И.Р. Эрлиха и соавт. [17] демонстрируют изменения в кардиомиоцитах с наличием полиморфизма rs1805127: в этих клетках происходит снижение калиевого тока, продление потенциала действия, а также периода относительной рефрактерности, что в свою очередь способствует возникновению ранней постдеполяризации в кардиомиоцитах в некоторых специфических условиях. По мнению авторов, перечисленные изменения могут приводить к преобладанию тахиаритмий у носителей данного полиморфизма при сравнении с их частотой в общей популяции.

Интерес к изучению гена калиевых каналов у пациентов с тиреотоксикозом обусловлен еще и тем, что тиреоидные гормоны могут изменять ионные потоки в кардиомиоцитах и влиять на экспрессию генов, кодирующих ионные каналы [18]. Это может привести к усилению эффектов мутаций в генах калиевых каналов при тиреотоксикозе. В исследовании на кардиомиоцитах желудочков морских свинок было показано, что трийодтиронин усиливает входящий калиевый ток выпрямления, что является одной из причин укорочения длительности потенциала действия при тиреотоксикозе [19]. Кроме того, в литературе- имеются данные о том, что в кардио-миоцитах мышей с избытком тиреоидных гормонов уменьшается количество матричной РНК, кодирующей белок minK [20].

Результаты многих проведенных на настоящий момент исследований свидетельствуют о том, что полиморфизм Ser38Gly увеличивает риск фибрилляции предсердий как в гомозиготном, так и гетерозиготном состоянии [21–23]. В нескольких исследованиях [24–27] частота аллеля 38G была значительно выше у пациентов с фибрилляцией предсердий по сравнению с контрольной группой: 76,4 vs 63,0%, p < 0,0024 [24]; 62,3 vs 41,8%, p = 0,009 [28]; 65,8 vs 58,2%, p = 0,005 [26]. Причем была обнаружена корреляция между числом аллелей “предрасположенности” и частотой развития фибрилляции предсердий: отношение шансов увеличивалось на 1,8 для каждого аллеля 38G [24]. Авторы одного из исследований доказали, что полиморфизм rs1805127 является независимым фактором риска фибрилляции предсердий [26]. В 2013 г. был проведен метаанализ десяти исследований “случай–контроль”. Из них только два проводились на европейской популяции, остальные же работы были выполнены в странах Азии. Во всех исследованиях полиморфизм Ser38Gly гена minK-пептида был ассоциирован с увеличением риска развития фибрилляции предсердий. Тем не менее, по данным некоторых научных публикаций, полиморфизм Ser38Gly не оказывает значимого влияния на частоту фибрилляции предсердий [29].

Кроме того, была обнаружена связь этого полиморфизма с размером левого предсердия и конечным диастолическим размером левого желудочка у пациентов с фибрилляцией предсердий [26]. В некоторых исследованиях связь мутации с размером левого предсердия не подтверждена [29].

Таким образом, мы предположили, что вышеописанный однонуклеотидный полиморфизм может являться предиктором тяжелого течения тиреотоксической кардиомиопатии вследствие повышения риска развития фибрилляции предсердий, а также, вероятно, других предсердных нарушений ритма. Нельзя исключить и ухудшение процессов ремоделирования миокарда.

Цель

Оценить вклад однонуклеотидного полиморфизма Ser38Gly гена â-субъединицы потенциал-зависимых- К⁺-каналов миокарда (minK) в тяжесть поражения сердечно-сосудистой системы при тиреотоксикозе, ассоциированном с болезнью Грейвса.

Задачи исследования

1. Изучить распределение генотипов и частоту встречаемости аллелей по полиморфизму Ser38Gly гена â-субъединицы потенциал-зависимых К⁺-каналов миокарда (minK) у пациентов с болезнью Грейвса и манифестным тиреотоксикозом.

2. Оценить влияние полиморфизма в 38-м кодоне гена minK на частоту развития наджелудочковых нарушений ритма, характер ремоделирования миокарда, частоту развития легочной гипертензии и вторичной артериальной гипертензии (АГ) при тиреотоксикозе.

Материал и методы

Обследовано 155 больных с тиреотоксикозом, обусловленным болезнью Грейвса.

Критерии включения пациентов в исследование

1. Мужчины и женщины с дебютом болезни Грейвса и проявлениями тиреотоксикоза в возрасте от 18 до 55 лет.
2. Лабораторно подтвержденный, впервые выявленный тиреотоксикоз.
3. Наличие клинических симптомов тиреотоксикоза.
4. Диагноз болезни Грейвса, подтвержденный по данным ультразвукового исследования щитовидной железы с оценкой скорости кровотока/сцинтиграфии щитовидной железы с захватом йода и анализа титра антител к рецептору тиреотропного гормона (ТТГ).
5. Отсутствие сопутствующих заболеваний, которые могли бы оказать влияние на структурно-функциональное состояние сердца (ишемическая болезнь сердца, гипертоническая болезнь, клапанные поражения, кардиомиопатии нетиреотоксического генеза, сахарный диабет, обструктивные заболевания легких, сердечная недостаточность и гемодинамически значимые нарушения ритма нетиреотоксического генеза), исключение интоксикаций (алкоголизм, токсикомания).
6. Эутиреоз, гипотиреоз или субклинический тиреотоксикоз.
7. Наличие в анамнезе АГ/легочной гипертензии до дебюта тиреотоксикоза.
8. Сахарный диабет или нарушение толерантности к глюкозе.
9. Ишемическая болезнь сердца, гипертоническая болезнь, клапанные поражения, кардиомио-патии нетиреотоксического генеза, обструктивные заболевания легких, сердечная недостаточность и гемодинамически значимые нарушения ритма нетирео-токсического генеза.
10. Хронические интоксикации (алкоголизм, токсикомания).

Критерии исключения пациентов из исследования

В качестве контроля по генетическим исследованиям использовалась сопоставимая по полу и возрасту группа здоровых лиц (доноров крови), жителей Санкт-Петербурга. Объем контрольной группы – 187 пациентов без заболеваний щитовидной железы, с эутиреозом, без ишемической болезни сердца и других тяжелых патологий.

Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ “СЗ ФМИЦ им. В.А. Алмазова”. У всех пациентов предварительно было получено информированное согласие на проведение данного исследования.

Обследование включало оценку следующих характеристик:

1. Определение уровня ТТГ, свободного тетра-йодтиронина (св.Т₄), свободного трийодтиронина (св.Т₃).
2. Определение уровня систолического и диастолического артериального давления (АД) путем суточного мониторирования АД.
3. Определение частоты сердечных сокращений (ЧСС).
4. Измерение некоторых морфологических и функциональных характеристик сердца (эхокардиография (ЭхоКГ)).
5. Выявление и уточнение характера имеющихся нарушений ритма путем опроса на наличие клинических проявлений аритмии и проведения холтеровского мониторирования электрокардиограммы.

Гормональные исследования

Уровень свободных тиреоидных гормонов и антител в сыворотке крови определялся иммуноферментным методом с помощью анализатора ACCESS2 (Beckman Coulter, США) и иммунохимических анализаторов (UNICEL DXI 800 ACCESS, Beckman Coulter): св.Т₃ (норма: 4,0–8,0 пмоль/л), св.Т₄ (норма: 10–25 пмоль/л), ТТГ (норма: 0,25–3,5 мМЕ/л).

Эхокардиографическое исследование

ЭхоКГ выполнялась на аппарате Sonoline GGOS (Siemens) и включала измерение следующих параметров: диаметра левого предсердия, массы миокарда левого желудочка (ММЛЖ), толщины межжелудочковой перегородки (ТМЖП) и задней стенки левого желудочка (ТЗСЛЖ), давления в легочной артерии (рЛА). Относительная толщина стенок и индекс массы миокарда левого желудочка (ИММЛЖ) рассчитывались по формулам, рекомендованным ASE-2005 [31]. Для описания геометрии левого желудочка использовалась классификация G. Ganau [30]: нормальная геометрия, эксцентрическая гипертрофия, концентрическое ремоделирование, концентрическая гипертрофия.

Генетическое обследование

Выделение ДНК выполнялось из цельной крови с помощью фенол-хлороформной экстракции по стандартной методике.

Типирование однонуклеотидного полиморфизма Ser38Gly (rs1805127) гена KCNE1 проводилось методом полимеразной цепной реакции с автоматической детекцией результатов амплификации в режиме реального времени (real time PCR). Прибор для проведения real time PCR – Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System. Использовались стандартные параметры термического цикла для анализа по распознаванию аллелей в соответствии с инструкциями производителя. Для амплификации полиморфизма гена KCNE1 использовался набор праймер + зонд фирмы Applied Biosystem, содержащий прямой и обратный праймеры, фланкирующие полиморфный участок локуса 21q22.12 на 21-й хромосоме, а также флуоресцентный зонд TaqMan, содержащий красители VIC для аллеля G и FAM для аллеля A. Реакционная смесь для проведения real time PCR также стандартного состава, фирмы “Синтол”.

Статистическая обработка данных

Анализ различий в распределении генотипов и в частоте встречаемости аллелей между контрольной и основной группами проводили с использованием критерия c². С помощью этого же метода был выполнен тест на соответствие изучаемых выборок равновесию Харди–Вайнберга: метод c² (a = 0,05, df = 1).

Оценка наличия зависимости от генотипа различных параметров сердечно-сосудистой системы, представленных интервальными переменными, производилась с использованием теста Краскела–Уоллиса (при сравнении всех трех генотипов между собой) или с помощью теста Манна–Уитни (при сравнении двух выборок). Для анализа некоторых данных ЭхоКГ (диаметр левого желудочка (ДЛЖ) и ИММЛЖ) использовался однофакторный дисперсионный анализ, так как эти переменные имели нормальное распределение. Нормальность распределения оценивалась с помощью теста Колмогорова–Смирнова. Сравнение частот встречаемости нарушений ритма и некоторых других патологий сердечно-сосудистой системы (гипертрофия левого желудочка (ГЛЖ), легочная гипертензия) (номинальные переменные) проводилось по методу c².

Во всех тестах различия считались достоверными при уровне значимости р < 0,05. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы SPSS 17.0.

Результаты и обсуждение

Характеристика основной группы

Основные параметры степени тяжести тиреотоксикоза по данным лабораторных исследований и клинико-анамнестические данные группы пациентов с тиреотоксикозом представлены в табл. 1.

По результатам генотипирования среди пациентов с тиреотоксикозом частота встречаемости аллелей A и G составила 0,33 и 0,67 соответственно (табл. 2). При анализе распределения генотипов оказалось, что преобладают лица, гомозиготные по аллелю G: 47,1% (n = 73) пациентов были носителями генотипа GG (Gly38Gly), 13,6% (n = 21) имели генотип AA (Ser38Ser) и 39,3% (n = 61) – AG (Ser38Gly).

При оценке результатов генотипирования группы контроля распределение генотипов было следующим: AA – 10,7% (n = 20), AG – 51,3% (n = 96), GG – 38% (n = 71) (табл. 3). Частота встречаемости аллеля A составила 0,36, аллеля G – 0,63 (табл. 2). Распределение генотипов в обеих исследуемых группах (болезнь Грейвса, контроль) соответствовало равновесию- Харди–Вайнберга: в тесте Харди–Вайн-берга p = 0,16 и p = 0,14 соответственно.

Между группами пациентов с различными вариантами гена KCNE1 был проведен сравнительный анализ лабораторных и некоторых других параметров, которые могли бы повлиять на поражение сердечно-сосудистой системы при тиреотоксикозе (табл. 4). Различий по таким параметрам, как возраст, длительность тиреотоксикоза, уровень тиреоидных гормонов и ТТГ, выявлено не было. При анализе гендерного состава группы статистически значимых отличий также не было обнаружено, но было отмечено отсутствие лиц мужского пола среди пациентов с генотипом АА.

Также в нашем исследовании была проанализирована частота различных сердечно-сосудистых проявлений тиреотоксикоза (табл. 5). В результате проведенного поиска наличия корреляции различных параметров, оценивающих работу сердечно-сосудистой системы, с полиморфизмом rs1805127 гена KCNE1 в группе пациентов с тиреотоксикозом была выявлена статистически достоверная разница в уровне АД между генотипами (табл. 6). Систолическое АД было ниже у носителей аллеля G в гомозиготном состоянии- по сравнению с гетерозиготами и гомозиготами по аллелю A в совокупности: 124,89 ± 15,14 vs 131,35 ± 15,32 мм рт. ст. (p = 0,012) (рисунок). Статистически значимая разница была и при сравнении уровня АД между всеми тремя генотипами (тест Краскела–Уоллиса, p = 0,025). Сравнение уровня диастолического АД между тремя генотипами этим способом не показало статистически достоверной разницы (р = 0,120). Дополнительно мы провели анализ сравнения среднего диастолического АД в группе пациентов с генотипом GG относительно носителей аллеля A (GG vs AG+AA) – 73,83 ± 9,23 vs 77,17 ± 9,51 мм рт. ст. (p = 0,05). То есть можно говорить о тенденции к более низкому уровню диастолического АД у лиц с генотипом GG. Однако средний уровень АД во всех группах не превышал нормальных значений. Для уточнения наличия роли данного генотипа в развитии вторичной АГ при тиреотоксикозе была выполнена оценка количества пациентов с вторичной АГ, развившейся на фоне тиреотоксикоза. Их доля составила 31,6% для носителей аллеля А в гомозиготном состоянии, 40,7% для гетерозигот и 22,9% для лиц с генотипом GG (табл. 7). Складывается представление, что существует тенденция к более частому развитию вторичной АГ при тиреотоксикозе у носителей “дикого” генотипа AA, хотя значения р (р = 0,093) позволяют нам говорить лишь о тенденции. При сравнении генотипа GG с другими генотипами в совокупности (GG vs AG+AA, 22,9 vs 38,5%) эта разница становится статистически достоверной: р = 0,041.

Одной из основных задач нашего исследования было установить наличие или отсутствие ассоциации полиморфизма rs1805127 гена KCNE1 с фибрилляцией предсердий. Незначительно выше частота фибрилляции предсердий оказалась у носителей генотипа GG: 21,9 vs 13,1% (AG) и 19% (AA) (табл. 8). При статистическом анализе данных эти различия оказались недостоверными: p = 0,372 при сравнении GG vs AA+AG и р = 0,416 при сравнении всех трех генотипов между собой. Известно, что возраст влияет на риск развития фибрилляции предсердий. Поэтому был выполнен анализ влияния генотипа на частоту развития фибрилляции предсердий в разных возрастных группах. В первую группу вошли пациенты моложе 45 лет, а во вторую – 45 лет и старше. В первой группе не было обнаружено статистически значимых корреляций (табл. 9). В старшей возрастной группе при сравнении всех трех генотипов между собой была выявлена тенденция к более частому развитию фибрилляции предсердий у носителей генотипа GG: 35,3 vs 12,0% (AG) и 18,2% (AA) (р = 0,105). Эти данные согласуются с результатами исследований, изучавших нетиреотоксическую фибрилляцию предсердий. В литературе имеются данные о том, что каждый аллель G увеличивает риск развития фибрилляции предсердий [24]. В наших данных обращает на себя внимание более высокая частота фибрилляции предсердий у пациентов с генотипом АА в сравнении с гетерозиготами. Этот факт может указывать на малую выборку лиц с “ редким” генотипом АА. В связи с этим мы провели сравнение частоты фибрилляции предсердий между пациентами с генотипом GG и группой, объединяющей всех носителей аллеля А (AG и AA в совокупности). Оказалось, что фибрилляция предсердий достоверно чаще развивается у лиц с генотипом GG: 35,3% (GG) vs 13,9% (AG+AA) (p = 0,037) (рисунок).

Кроме фибрилляции предсердий мы оценили влияние полиморфизма Ser38Gly гена KCNE1 на другие нарушения ритма, часто встречающиеся у больных с тиреотоксикозом: синусовую тахикардию, наджелудочковую экстрасистолию, а также зависимость ЧСС от генотипа. Статистически значимых различий между носителями различных генотипов по этим параметрам обнаружено не было (табл. 10).

Кроме того, была проведена оценка некоторых параметров ЭхоКГ: ТЗСЛЖ, толщина межпредсердной перегородки, диаметр левого предсердия (ДЛП), ИММЛЖ. При анализе результатов статистически значимых различий в зависимости от генотипа не было обнаружено. Результаты представлены в табл. 11.

После изучения параметров эхокардиографии в отдельности все пациенты были распределены по четырем группам в зависимости от характера ремоделирования миокарда согласно классификации A. Ganau [30]. Распределение частот встречаемости различных- типов ремоделирования миокарда оказалось сходным во всех трех группах (табл. 11).

Одним из достаточно часто встречающихся изменений сердечно-сосудистой системы при тиреотоксикозе является легочная гипертензия. В нашем исследовании значимой разницы по уровню рЛА среди носителей разных генотипов выявлено не было (табл. 12). Была проанализирована также частота встречаемости случаев легочной гипертензии, она составила 37,8% по данным обследования 127 пациентов (у 28 человек уровень рЛА не был измерен). Критерий постановки диагноза легочной гипертензии – рЛА ³35 мм рт. ст. При сравнении частоты развития легочной гипертензии у групп пациентов с разными генотипами статистически достоверной разницы также не было обнаружено: р = 0,396. Частота случаев развития легочной гипертензии в группах с генотипами AA, AG и GG – 42,1, 30,8 и 42,9% соответственно.

Заключение

По результатам проведенного исследования выявлена ассоциация полиморфизма rs1805127 гена KCNE1 с фибрилляцией предсердий в старшей возрастной группе пациентов (45 лет и старше). Однако эта связь менее значима, чем в эутиреоидной популяции, так как, по данным литературы, ассоциация фибрилляции предсердий с полиморфизмом Ser38Gly гена KCNE1 у людей без патологии щитовидной железы не зависит от возраста и коррелирует с числом аллеля “предрасположенности” G [24, 26, 27]. Отсутствие зависимости частоты фибрилляции предсердий от изучаемого полиморфизма среди пациентов моложе 45 лет доказывает, что его влияние незначительно по сравнению с “классическими”, подтвержденными ранее во многих исследованиях факторами риска.

При анализе ассоциации изучаемого полиморфизма Ser38Gly гена KCNE1 со степенью тяжести и типом ремоделирования миокарда не было обнаружено ни достоверных отличий в зависимости от генотипа, ни тенденций к ним. При этом у лиц с эутиреоидным статусом, по данным литературы, была обнаружена связь полиморфизма Ser38Gly с размером левого предсердия и конечным диастолическим размером левого желудочка [26].

Ранее нами были изучены влияния на развитие и течение ТКМП других полиморфизмов, ассоциированных с нетиреотоксической фибрилляцией предсердий, – Gly389Arg и Ser49Gly в гене â₁-адренорецепторов, а также полиморфизма в гене дейодиназы 2-го типа Thr92Ala [6–9]. Результаты этих исследований не позволяют сделать вывод о наличии ключевой роли генетических факторов в формировании ТКМП. Тем не менее, учитывая результаты настоящего исследования, о полном отсутствии связи с генетическими детерминантами при тиреотоксикозе говорить нельзя.

Для окончательного решения вопроса о целесообразности генетического обследования лиц с тиреотоксикозом и болезнью Грейвса на практике необходимо продолжать поиск и изучение новых возможных генетических предикторов тяжелого течения ТКМП.

Информация о финансировании и конфликте интересов

Работа выполнена в рамках реализации Государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации “Фундаментальные научные исследования” (прикладные научные исследования или экспериментальные разработки) по теме “Генетические факторы, оказывающие влияние на развитие и течение тиреотоксической кардиомиопатии у пациентов с болезнью Грейвса”.

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Информация о вкладе каждого автора

Савицкая Д.А. – анализ научной литературы по теме исследования, сбор, систематизация и обработка материала, в том числе генотипирование, оценка и анализ полученных данных, написание текста рукописи.

Бабенко А.Ю. – концепция и дизайн исследования, сбор материала (подбор когорты пациентов), окончательная оценка полученных данных, написание и редактирование текста рукописи.

Костарева А.А. – концепция и дизайн исследования, помощь в проведении генотипирования.

Гринева Е.Н. – концепция и дизайн исследования.