Лабораторные биомаркеры дифференцированного рака щитовидной железы

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время рак щитовидной железы занимает 4-е место по распространенности злокачественных новообразований у женщин, а к 2030 г. рак щитовидной железы, как ожидается, займет 3-е место среди наиболее распространенных онкологических заболеваний у женщин [1]. Дифференцированный рак щитовидной железы (ДРЩЖ), включающий папиллярный рак щитовидной железы (ПРЩЖ) и фолликулярный рак щитовидной железы, составляет подавляющее большинство (более 90%) всех видов рака щитовидной железы [2]. Однако ежегодная смертность от рака щитовидной железы, составляющая 0,38 случая на 100 000 населения (0,35 — среди мужчин, 0,39 — среди женщин), остается относительно стабильной [3].

В действительности подобные изменения в структуре заболевания могут быть связаны с улучшением качества ранней диагностики и своевременно проведенным лечением [2].

При выявлении узлового образования во время проведения ультразвукового скрининга рекомендуется характеризовать узел щитовидной железы с использованием стандартизированной системы описания протокола ультразвукового исследования щитовидной железы (EU-TIRADS) [4]. При подозрении на злокачественную природу образования щитовидной железы по EU-TIRADS показано выполнение тонкоигольной аспирационной биопсии. В качестве лабораторной диагностики необходимы оценка уровня тиреотропного гормона (ТТГ) для исключения функциональной автономии узла, а также измерение уровня кальцитонина в сыворотке крови в качестве дифференциальной диагностики медуллярного рака щитовидной железы [2]. Принимая во внимание недоказанную эффективность и ограничение в интерпретации результатов других биомаркеров, их использование в настоящее время не рекомендуется [2].

Тиреоглобулин (ТГ) — специфический белок ткани щитовидной железы, который является достоверным биохимическим маркером активности заболевания после выполнения тиреоидэктомии и, в соответствии с текущими рекомендациями по дифференцированному раку щитовидной железы, может использоваться в качестве скрининга для наблюдения пациентов в послеоперационном периоде [2]. Тем не менее полезность измерения ТГ ограничена в связи с наличием антител к ТГ (АТ-ТГ), которые могут встречаться у 25–30% пациентов с ДРЩЖ [5]. Интересно заметить, что наличие как АТ-ТГ, так и АТ к тиреопероксидазе (АТ-ТПО) примерно в 2 раза выше при ДРЩЖ (особенно папиллярном варианте) по сравнению с общей популяцией [6], что указывает на возможную связь между аутоиммунным заболеванием щитовидной железы и раком щитовидной железы.

Таким образом, в этом обзоре будут рассмотрены применяемые в клинической практике биомаркеры, а также недавно описанные потенциальные альтернативы, их преимущества и недостатки (табл. 1).

Тиреоглобулин

ТГ — это большой (660 кДа) гликопротеин, участвующий в выработке гормонов щитовидной железы. Он синтезируется в ответ на стимуляцию рецептора тиреотропного гормона (рТТГ) тиреотропином как в нормальных клетках щитовидной железы, таки в клетках рака щитовидной железы. Различия в сплайсинге мРНК ТГ и посттрансляционной модификации делают ТГ гетерогенной молекулой, которая содержится в коллоидном веществе тироцитов. Тиреоглобулин попадает в кровоток как побочный продукт нормальной выработки гормонов щитовидной железы, а также как вторичный маркер — по отношению к любой травме щитовидной железы [7][8].

Van Herle A. и коллеги впервые представили оценку уровня ТГ с помощью двойного радиоиммуноанализа (РИА) в 1973 г. [9]. В 1975 г. та же команда использовала анализ ТГ для пациентов с раком щитовидной железы, у которых уровень ТГ дооперативного лечения был 144,3±46,5 нг/мл и снизился до 6,4±1,5 нг/мл после ­операции, а у ­пациентов с подтвержденными метастазами еще более повысился и составил 464,9±155,6 нг/мл [10]. Функциональная чувствительность РИА варьирует от 5 до15 мг/л и недостаточна для выявления очень низких уровней ТГ у пациентов с ДРЩЖ. Таким образом, в настоящее время применение РИА в клинической практике очень ограничено [8].

На сегодняшний день для измерения ТГ используется иммунометрический анализ (ИМА). Преимущества использования ИМА в том, что ИМА менее трудоемок, более автоматизирован, имеет короткие сроки получения результата, а благодаря использованию избытка реагентов этот метод более чувствителен (менее чем 0,1 мг/л), что идеально подходит для наблюдения за пациентами после радикального лечения рака щитовидной железы [11][12]. Ограничением ИМА является его неспецифичность по отношению к АТ-ТГ, гетерогенным антигенам и антителам, которые могут вызывать либо ложно сниженный ТГ, либо ложно высокий ТГ [8]. Измерение ТГ методом жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС) было предложено как возможное решение для точного количественного определения ТГ, несмотря на присутствие АТ-ТГ, гетерогенных антигенов и антител. ЖХ-МС основан на количественном определении пептидов после триптического расщепления и иммунного захвата ТГ-специфического пептида [13][14]. Однако ряд клинических исследований не смог показать очевидного преимущества ЖХ-МС у АТ-ТГ-положительных пациентов с ДРЩЖ по сравнению с ИМА [15][16]. Кроме того, рентабельность и чувствительность ИМА намного выше, чем ЖХ-МС [5][17]. В настоящее время в клинической практике большинство лабораторий предпочитает использовать ИМА II поколения для измерения ТГ, в то время как использование ЖХ-МС ограничено.

Отмечено, что послеоперационное значение стимулированного ТГ менее 1–2 нг/мл является стойким прогностическим признаком ремиссии заболевания [18][19]. Однако на прогностическую ценность послеоперационного значения ТГ также влияет широкий спектр факторов: остаточный объем щитовидной железы, уровень тиреотропина во время измерения ТГ, чувствительность выбранного метода анализа ТГ, независимо от того, проводилась ли радиойодтерапия [2] и т. д. В текущих клинических рекомендациях по дифференцированному раку щитовидной железы при динамическом наблюдении рекомендуется измерять уровень ТГ вместе с анатомической и функциональной визуализацией [2].

Резюмируя вышесказанное, важность определения ТГ в сыворотке крови после оперативного лечения не вызывает сомнений, однако в предоперационном периоде его определение неинформативно.

Антитела к тиреоглобулину

АТ-ТГ можно обнаружить несколькими методами. Более 50 лет назад начали использовать метод прямого измерения АТ-ТГ в сыворотке, однако в настоящее время он является самым нечувствительным качественным методом. В 1970-х гг. был разработан полуколичественный тест пассивной гемагглютинации, который мог определять титры антител. Позже стал доступен конкурентный РИА, но в последнее время большинство лабораторий приняло неконкурентный метод ИМА, который является неизотопным, автоматизированным, а также стандартизирован в соответствии с «Международными биологическими эталонными препаратами ВОЗ» [17]. Вместе с тем результаты исследования АТ-ТГ часто противоречат друг другу [20]. Во-первых, разные методы могут вызвать расхождения. В исследовании Latrofa F. и коллег выявляемость АТ-ТГ при ИМА была значительно выше, чем при РИА [20]. Во-вторых, гетерогенные и поликлональные популяции АТ-ТГ могут вносить вклад в расхождения. АТ-ТГ каждого пациента имеет характерный подкласс IgG и специфичность для распознавания реагента анализа на ТГ [21], поэтому один и тот же образец сыворотки может давать разные результаты определения уровня АТ-ТГ разными методами. В-третьих, внутренние стандарты анализов АТ-ТГ связаны с «Международными биологическими эталонными препаратами ВОЗ», которые имеют значение для уменьшения расхождений и должны быть рекомендованы всем лабораториям для выполнения [20].

АТ-ТГ также можно определить с помощью теста восстановления, который может представлять собой простую и недорогую альтернативу для обнаружения потенциальных помех АТ-ТГ или гетерогенных антигенов и антител [5]. Обычно тест восстановления включает измерение концентраций ТГ до и после добавления известного количества ТГ к аликвоте исследуемого образца сыворотки. Степень восстановления более 80% считается отсутствием помех [17]. Однако было указано, что при использовании обычного буфера для восстановления, содержащего 40–50 нг/ мл ТГ, будут показаны только сильные помехи, что приведет к низкой чувствительности обнаружения ТГ 5 нг/мл. В современной клинической практике актуален уровень менее 1 нг/мл. Как следствие, тестирование восстановления ТГ больше не считается адекватным [5].

В настоящее время нет достоверных альтернатив оценке ТГ и АТ-ТГ с достаточной чувствительностью и специфичностью для клинического использования. Однако были предприняты попытки идентифицировать возможных кандидатов, например, микроРНК (миРНК, англ. miRNA, miR) ТГ, циркулирующую миРНК (miRNA/miR), мутацию BRAF (T1799A), длинную некодирующую РНК (днРНК, lncRNA), мидкин, цитокератин-19 (Cytokeratin-19, CK19), белок сосудистой адгезии-1 (Vascular adhesion protein-1, VAP-1), средний объем тромбоцитов (Mean platelet volume, MPV) и т. д.

мРНК тиреоглобулина

Boldarine V. и коллеги сообщили о разработке количественного анализа мРНК ТГ с использованием праймеров, расположенных в области, не затронутой альтернативным сплайсингом или однонуклеотидными полиморфизмами [29]. Используя этот анализ, авторы смогли точно отличить пациентов с персистирующим или рецидивирующим течением (22 из 104) от пациентов, не страдающих заболеванием (82 из 104) (p<0,0001). На это измерение мРНК ТГ присутствие АТ-ТГ не влияло.

Мутация BRAF (T1799A)

Была протестирована другая альтернативная стратегия, основанная на обнаружении мутации BRAF (T1799A) в периферической крови пациентов с ПРЩЖ. Cradic K. и коллеги [30] разработали аллель-специфичный метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для обнаружения мутации BRAF в образцах крови 193 пациентов с раком щитовидной железы. Циркулирующий BRAF (T1799A) был обнаружен у 11,56% (20/173) пациентов с ПРЩЖ и 0% (0/20) пациентов без ПРЩЖ. Статус BRAF в крови хорошо коррелировал со статусом BRAF паренхимы щитовидной железы, а также с наличием активного заболевания на момент обследования. Однако другие сопутствующие злокачественные новообразования, такие как меланомы [31], могут вызывать ложноположительные результаты. Пока что обнаружения мутаций в периферической крови недостаточно чувствительно для клинического использования.

Циркулирующая миРНК (miRNA/miR)

Повышенный уровень miRNA обнаруживается в ПРЩЖ в разных популяциях, что указывает на роль miRNA в канцерогенезе щитовидной железы. В одном австралийском исследовании было обнаружено, что miR-222 и miR-146b экспрессируются в 10,8и 8,9 раза выше нормы соответственно при ПРЩЖ и связаны с его рецидивом [32]. Используя анализ человеческого микрочипа на платформе ABI 7900, Dettmer M. и коллеги сообщили, что повышенная экспрессия miR-375 может служить новым маркером ПРЩЖ, а miR-181a-2-3p и miR-99b-3p могут предсказывать безрецидивную выживаемость у пациентов с фолликулярным вариантом ПРЩЖ [33]. Yu S. и коллеги обнаружили, что экспрессия в сыворотке let-7e, miR-151-5p и miR-222 была значительно увеличена в случаях ПРЩЖ [34]. В другом итальянском исследовании [35] циркулирующие miRNA и miR-190 были обнаружены в крови пациентов и рассматривались как высокочувствительные маркеры при ПРЩЖ. Чувствительность miR-95 составляла 94,9%, достигая 100% в многомерной модели риска в сочетании с miR-190.

Длинная некодирующая РНК (днРНК)

В многоцентровом исследовании секвенирования всего экзома (подтвержденного секвенированием по Сэнгеру) в Китае изучались соматические мутации для ПРЩЖ с использованием 402 пар «опухоль–нормальная ткань» [36]. Среди 10 идентифицированных мутировавших генов, ген, отвечающий за экспрессию днРНК GAS8-AS1, отличался наибольшей вариабельностью при ПРЩЖ (действуя как новый супрессор опухолей). ДнРНК GAS8-AS1 дикого типа продемонстрировала более высокую способность ингибировать рост раковых клеток по сравнению с мутантной lncRNA. Позже, в другом исследовании [37], плазменная концентрация днРНК GAS8-AS1 у 97 пациентов с ПРЩЖ и 39 пациентов с узловым зобом была проанализирована с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Экспрессия GAS8-AS1 в плазме подавлялась у пациентов с ПРЩЖ и отрицательно коррелировала с метастазами в лимфатические узлы.

Мидкин

Мидкин, гепаринсвязывающий фактор роста, играет важную роль в канцерогенезе, воспалении и ангиогенезе. Kuzu F. и коллеги оценили уровень мидкина в сыворотке и в узловом образовании у пациентов с узлами щитовидной железы [38]. Как сывороточный мидкин, так и узловой мидкин могут прогнозировать онкогенез злокачественной/подозрительной цитопатологии щитовидной железы, а также хорошо коррелируют с сонографическими характеристиками узелков. Meng Z. и коллеги обнаружили жизнеспособную диагностическую способность мидкина дифференцировать ДРЩЖ от доброкачественных узлов щитовидной железы до операции (пороговое значение: 323,12 пг/мл, диагностическая точность: 75,31%) [39]. Уровень мидкина перед радиойодтерапией также продемонстрировал хорошую способность предсказывать мета­стазы (пороговое значение: 504,71 пг/мл, диагностическая точность: 89,25%). Пациенты с ДРЩЖ с уровнями мидкина или ТГ выше пороговых значений (500 пг/мл и 20 нг/мл соответственно) показали значительно меньшую выживаемость без метастазов по методу Каплана–Мейера (p<0,01). В последующем исследовании Li N. и коллеги использовали регрессию Кокса для изучения динамических изменений мидкина в сыворотке в качестве прогностического фактора для мониторинга статуса заболевания в ПРЩЖ в течение 10–12-месячных интервалов [40]. Авторы установили, что в случае если уровень мидкинов снижается, но не до нормального уровня, риск метастазов составляет 3,006. Если уровень мидкина повышался, риск метастазирования составлял 5,030. Два предыдущих иммуногистохимических исследования [41, 42] также подтвердили, что экспрессия мидкина хорошо коррелирует с клинико-патологическими особенностями мутации генома клеток щитовидной железы при ПРЩЖ и BRAF и потенциально может использоваться для дифференциальной диагностики между ПРЩЖ и многоузловым зобом, а также для прогнозирования отдаленных метастазов.

Цитокератин-19 (Cytokeratin 19, CK-19)

Раковые клетки ДРЩЖ экспрессируют CK-19, который является одним из видов цитокератинов, составляющих промежуточные филаменты цитоскелета [43]. Giovanella L. и коллеги измерили сывороточный фрагмент CK-19 (Cyfra 21.1) в течение 6–12 мес после начального лечения у 473 пациентов с ДРЩЖ [44]. Уровень Cyfra 21.1 менее 2,07 нг/мл был связан с благоприятным исходом, в то время как более высокий уровень значительно увеличивал риск рецидива и смерти.

Белок сосудистой адгезии-1 (Vascular adhesion protein-1, VAP-1)

VAP-1 представляет собой гликопротеин, опосредующий тканеспецифическую адгезию лимфоцитов. Hu Z. и коллеги обследовали 126 пациентов с узлами щитовидной железы и 53 здоровых человека в контрольной группе и измерили уровень VAP-1в сыворотке с помощью иммунофлюориметрического анализа с временным разрешением [45]. Было обнаружено, что уровни VAP-1 в сыворотке крови при раке щитовидной железы были значительно ниже, чем в контрольной группе здоровых людей и при доброкачественных узлах щитовидной железы. Было установлено, что оптимальное пороговое значение составляет 456,6 нг/мл со специфичностью 77,4% и чувствительностью 66,7% для диагностики рака щитовидной железы.

Средний объем тромбоцитов (Mean platelet volume, MPV)

MPV — ранний индикатор активации тромбоцитов. В таких условиях, как воспаление или развитие опухолевого процесса, клетки продуцируют цитокины, и ожидается увеличение доли молодых тромбоцитов и MPV. Baldane S. и коллеги сравнили 66 случаев ДРЩЖ с 32 случаями зоба и 28 здоровыми людьми из контрольной группы [46]. Было обнаружено, что предоперационные уровни MPV в случаях ДРЩЖ были значительно выше по сравнению с другими случаями. Было определено пороговое значение 7,81 мкл для MPV (чувствительность 60% и специфичность 80%). В аналогичном исследовании Bayhan Z. и коллеги также доказали, что MPV может быть важным прогностическим фактором злокачественных новообразований щитовидной железы [47].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В связи с быстрым ростом заболеваемости ДРЩЖ определение сывороточных биомаркеров этого заболевания становится необходимостью. Однако до сих пор измерение ТГ в сочетании с АТ-ТГ является единственной клинически рекомендованной методикой. К сожалению, в настоящее время нет альтернатив имеющемуся сочетанию маркеров, но хочется верить, что будущие исследования помогут их отыскать.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Работа выполнена по инициативе авторов без привлечения финансирования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).