Прогнозирование течения высокодифференцированного рака щитовидной железы на основании дооперационного определения уровня экспрессии натрий-йодного симпортера

В последние годы в литературе появились данные об исследовании белка, ответственного за перенос йонов йода в клетках щитовидной железы, – натрий-йодного симпортера (НИС). Интерес к изучению этого белка связан с его функциональными особенностями, а именно – способностью к пере-носу через клеточную мембрану йода. В норме в организме этот белок локализуется в тиреоцитах и клетках лактирующей молочной железы. Уникальность локализации и функций этого белка вызывает интерес у ученых в связи с возможностью его использования в онкологии. В частности, активно исследуются его возможности в лечении радиоактивным йодом рака щитовидной железы. В случае высокодифференцированного рака щитовидной железы (ВДРЩЖ) диагностика рецидива или лечение локорегионарных или отдаленных метастазов с использованием радиоактивного йода осуществимы в связи с возможностью опухоли аккумулировать внутри клетки радиофармпрепарат (РФП). Эффективность радиойодтерапии (РЙТ) зависит от эффективной дозы РФП внутри клетки, что возможно лишь при сохранении функции НИС опухолевой ткани. Однако следует отметить, что при развитии опухолевого процесса и дедифференцировке опухолевой ткани большинство биохимических характеристик нормальной фолликулярной клетки теряются. Известно, что до 10% всех высокодифференцированных раков щитовидной железы в процессе дедифференцировки теряют способность накапливать радиоактивный йод внутри клетки, что делает невозможным выполнение радиойодабляции. Однако выделить эту группу пациентов на дооперационном этапе не представляется возможным.

В настоящее время большой интерес представляет прогнозирование течения рака, в частности рака щитовидной железы. В литературе нам удалось найти лишь одну статью M.R. Castro и соавт. (2001) [1], в которой авторы выявили связь развития радиойод-резистентных форм ВДРЩЖ со снижением уровня экспрессии НИС в первичной опухоли. То есть предпринята попытка выявить прогностический потенциал уровня экспрессии НИС и клинического течения ВДРЩЖ. Интересным патологоанатомическим исследованием является статья, опубликованная в 2009 г. О.О. Бондаренко и соавт. в журнале “Морфологiя”. В ней авторы выявили интересную тенденцию: нарушение иммуноэкспрессии НИС во всех опухолях щитовидной железы (от сверхэкспрессии и отсутствия мембранной экспрессии в диф-ференцированных карциномах до слабой, или фактически отсутствующей, в низкодифференцированных раках и Гюртле-клеточных опухолях) [2]. Можно предположить, что существует перспектива применения НИС как прогностического маркера. Однако ни одной работы, в которой описывалось бы влияние уровня экспрессии НИС на риск рецидива ВДРЩЖ после выполнения РЙТ, нами в современной литературе найдено не было. Данная гипотеза легла в основу проведенного нами ретроспективного исследования о прогностическом значении экспрессии НИС для ВДРЩЖ, опубликованного в 2015 г. [3]. Было выявлено, что способность тиреоцитов к захвату йода определяется уровнем только мембранной экспрессии НИС. Показано, что данный уровень при раке щитовидной железы ниже, чем в нормальной ткани щитовидной железы. А также наиболее интересным клиническим выводом является обнару-женная статистически значимая зависимость между уровнем экспрессии НИС и течением ВДРЩЖ, в том числе после выполнения РЙТ. И наиболее значимым является снижение уровня экспрессии менее 1%. То есть определение уровня снижения экспрессии НИС может быть использовано в качестве прогностического маркера рецидива после проведения РЙТ. Полученные на ретроспективном этапе данные легли в основу проспективного исследования. В связи с необходимостью дооперационного определения пациентов группы высокого риска рецидива заболевания с целью определения оптимального алгоритма хирургического и послеоперационного ведения необходим метод дооперационного определения уровня экспрессии НИС. А полученные на ретроспективном этапе данные нуждаются в проспективном подтверждении.

Цель

Исследовать возможности использования доопе-рационного определения уровня мембранной экс-прес-сии НИС методом проточной флюороцитометрии (ПФЦ) в материале тонкоигольной аспира-ционной биопсии (ТАБ) в качестве маркера неблагоприятного прогноза течения ВДРЩЖ.

Материал и методы

Исследование носило проспективный характер. Был исследован уровень экспрессии НИС в материале ТАБ у 43 больных с ВДРЩЖ, проходивших лечение в клинике общей хирургии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова в период с 2009 по 2011 г. Уровень экспрессии НИС оценивался количественно предложенным нами методом ПФЦ. Следует отметить, что методика проточного флюороцитометрического определения вошла в полученный по результатам данного исследования патент “Способ дооперационного определения объема хирургического лечения высокодифференцированного рака щитовидной железы” [4]. Средний возраст пациентов составил 47,4 ± 13,9 года; соотношение мужчин и женщин – 1 : 7 соответственно (табл. 1).

До операции всем пациентам была выполнена ТАБ под контролем ультразвукового исследования (УЗИ) с последующим цитологическим исследованием аспирата. Забор материала для ПФЦ-анализа проводился на дооперационном этапе при выполнении ТАБ узловых образований щитовидной железы под ультразвуковым контролем. На начальном этапе работы при отработке методики материал забирался дооперационно при ТАБ и интраоперационно. Ре-зуль-таты иммуногистохимического (ИГХ) и ПФЦ методов определения экспрессии НИС сравнивались, получены одинаковые результаты, что позволило полностью перейти на дооперационный забор материала.

Пунктат, полученный при ТАБ, подвергался цитологическому исследованию (с целью подтверждения наличия опухолевых клеток в пунктате), а смывы из иглы были использованы для выполнения иммуноцитометрического исследования. Далее материал для проточной цитометрии помещался в консервирующий раствор (фосфатный буфер и антикоагулянт) и хранился при температуре –18–20 С до момента исследования, но не более 10 дней. При ПФЦ-анализе на первом этапе суспензия клеток образцов ТАБ обрабатывалась неконъюгированными антителами к НИС (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), после инкубации при температуре +4 °С образцы отмывались фосфатно-солевым буфером (Santa Cruz Bio-techno-logy, Inc.).

На втором этапе образцы обрабатывались антителами, меченными FITC (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). После инкубации при температуре +4 °С образцы обрабатывались нормальной сывороткой (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) и отмывались фосфатно-солевым- буфером (Santa Cruz Biotechnology, Inc.).

На третьем этапе образцы обрабатывались прямыми меченными PE антителами к СD-45 (Beckman Coulter).

Анализ готовых проб проводился с помощью программы System II (Beckman Coulter) по разработанному протоколу для оценки событий по двум каналам: FL-1 для событий FITC-положительных и FL-2 для положительных по PE. Экспрессия НИС оценивалась в области определения CD45-клеток.

Окончательная верификация диагноза, стадирование процесса и определение показаний к РЙТ проводились по данным окончательного планового гистологического исследования.

Все пациенты были оперированы. Хирургическая тактика основывалась на клинических рекоменда-циях согласительной комиссии по диагностике и лечению дифференцированного рака щитовидной железы 2008 г.

Объем и характер выполненных оперативных вмешательств представлены в табл. 2.

По результатам планового гистологического исследования- у 28 пациентов определены показания к проведению РЙТ. В срок наблюдения до 48 мес рецидив заболевания был диагностирован в 10 случаях. Ни в одном случае у пациентов из группы без РЙТ не возникло рецидива заболевания (табл. 3).

Во всех 10 случаях рецидив носил локорегионарный характер. Все пациенты были повторно оперированы. Исследованию также подвергался материал ТАБ из области рецидива заболевания.

Результаты и их обсуждение

Проведенное ранее ретроспективное исследование показало, что НИС является чувствительным маркером способности клеток к захвату радиойода. Результатом анализа внутриклеточного распределения НИС стал вывод о том, что мембранная экспрессия белка отражает функциональную активность, а именно – способность к захвату ионов йода. Соответственно задачей проспективного этапа стал поиск метода определения мембранной экспрессии НИС в материале ТАБ на дооперационном этапе. В связи с этим нами была использована методика ПФЦ, которая позволяет определять белок, локализующийся на мембране, в то время как внутриклеточно локализованный белок, который является функционально неактивным, не определяется. В литературе мы не нашли описания использования ПФЦ для выявления экспрессии НИС в материале ТАБ. В связи с этим нами была отработана методика определения НИС в материале ТАБ при ВДРЩЖ методом ПФЦ. Полученные данные были проанализированы для определения прогностической ценности НИС при ВДРЩЖ.

В целом уровень экспрессии НИС, определенный методом ПФЦ в материале ТАБ, соответствовал данным, которые были получены при ретроспективном ИГХ-исследовании. При изучении экспрессии НИС в дооперационном материале высокодифференцированного рака мы также получили снижение мембранной экспрессии НИС. Однако изучаемая когорта пациентов была разнородна по уровню экспрессии НИС, что также соответствовало данным, полученным на первом этапе нашей работы. Так, уровень экспрессии колебался от 0 до 11,6%. Для изучения- корреляции уровня экспрессии НИС в первичной опухоли с риском рецидива заболевания проведен- анализ среднего значения уровня экспрессии НИС по группам.

В первой группе пациентов (15 больных, чей объем лечения ограничился только оперативным вмешательством) уровень экспрессии НИС был максимальным и доходил до 11,6%, средний же уровень экспрессии составил 6,2% (табл. 4).

Во второй группе больных (18 пациентов без рецидива заболевания в срок наблюдения до 48 мес после оперативного вмешательства и РЙТ) средний уровень экспрессии НИС первичной опухоли составил 4,9% (табл. 5).

Наибольший интерес представляет третья группа больных – 10 пациентов с рецидивом заболевания после РЙТ и оперативного вмешательства в срок наблюдения до 48 мес. При оценке уровня экспрессии НИС первичной опухоли выявлено значительное снижение уровня экспрессии НИС в среднем до 1% по данным ПФЦ-исследования (табл. 6).

Как видно из табл. 6, 60% пациентов с рецидивом заболевания имели уровень экспрессии НИС менее 1%.

Таким образом, наименьший средний уровень экспрессии НИС наблюдался в группе больных с рецидивом заболевания после РЙТ (р = 0,0028) и критичным для развития рецидива явилось снижение уровня экспрессии НИС до 1% и ниже. Так, в первой группе больных, где не было рецидива и показаний к РЙТ (стадия заболевания Т1-2N0M0), уровень экспрессии НИС был максимальный и равнялся 6,2%. Во второй группе, где были показания к РЙТ, но рецидива- не последовало (стадия Т1-4N0-1M0), уровень- экспрессии НИС был ниже, но не достигал критического значения 1% и ниже. В третьей группе пациентов с рецидивом после РЙТ уровень экспрессии НИС был достоверно самый низкий и в среднем не превышал 1%.

Проведенное исследование позволяет утверждать, что чем ниже экспрессия НИС, тем более агрессивное поведение опухоли, что может свидетельствовать о дедифференцировке со снижением способности к захвату йода.

При анализе влияния уровня экспрессии НИС на безрецидивную выживаемость у пациентов с ВДРЩЖ было показано, что длительность безрецидивной выживаемости достоверно ниже у пациентов с уровнем экспрессии НИС 1% и менее (р = 0,00392).

При построении кривых дожития Каплана–Мейера видно, что период безрецидивного выживания пациентов с уровнем экспрессии НИС менее 1% достоверно ниже (рисунок).

Таким образом, при проспективном анализе влияния уровня экспрессии НИС на безрецидивную выживаемость в группе больных с уровнем экспрессии НИС более 1% рецидив заболевания развился лишь в 10% случаев, тогда как в группе больных с уровнем экспрессии НИС менее 1% частота рецидивов достигла 50%. Следует отметить, что все пациенты с рецидивами заболевания прошли терапию радио-активным йодом. Таким образом, получается, что в каждом втором случае при уровне экспрессии менее 1% в первичной опухоли в срок до 48 мес мы можем ожидать рецидива/прогрессирования заболевания после выполнения РЙТ.

Таким образом, можно предположить, что рецидив в группе больных после РЙТ c уровнем экспрессии НИС менее 1% связан со сниженной чувствительностью опухоли к радиоактивному йоду.

Следовательно, при выявлении на дооперационном этапе уровня экспрессии НИС менее 1% мы можем предположить нечувствительность опухоли к РЙТ при ее необходимости. Как правило, окончательное стадирование по TNM происходит по результатам планового гистологического исследования и соответственно показания для РЙТ будут определены в послеоперационном периоде. В случае низкой экспрессии НИС проведение лечения радиоактивным йодом будет неэффективным и может потребовать повторного оперативного вмешательства, сопряженного с повышенным риском осложнений. Соответственно в случае рецидива или прогрессирования у данной группы больных опухоль будет резистентна к радиойоду и хирургический метод лечения будет единственно доступным. Таким образом, с целью предотвращения рецидива и/или персистирования ВДРЩЖ при выявлении на дооперационном этапе снижения уровня экспрессии НИС в первичной опухоли менее 1% целесообразно выполнение профилактической центральной шейной лимфодиссекции. Однако следует отметить небольшое количество наблюдений, что требует дальнейших исследований.

Выводы

1. Для дооперационного определения экспрессии НИС в материале ТАБ возможно использование метода ПФЦ.
2. Определение экспрессии НИС менее 1% у пациентов с ВДРЩЖ  может быть использовано в качестве дополнительного критерия включения в группу высокого риска.
3. Пациентам группы высокого риска показано выполнение тиреоидэктомии с центральной лимфодиссекцией.

Информация о финансировании и конфликте интересов

Исследование выполнено на деньги гранта “Участник молодежного научно-инновационного конкурса” (“УМНИК”), ФГБУ “Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере”. Других явных и потенциальных конфликтов в отношении данной статьи у авторов нет.