Редкая герминальная мутация с.2752 A>G (p.M918V) в протоонкогене RET, выявленная у больного с метастазами медуллярного и папиллярного рака щитовидной железы в лимфатических узлах шеи

Введение

Медуллярная карцинома щитовидной железы (МКЩЖ) – относительно редкий гистологический тип рака, составляющий 3–10% от всех тиреоидных неоплазий, с высокой долей наследственных форм (25–30%) [1, 2].Последние ассоциированы с аутосомно-доминантными синдромами множественной эндокринной неоплазии (МЭН) 2А, МЭН 2Б и семейной МКЩЖ. Причиной наследуемых МКЩЖ являются герминальные активирующиемиссенс-мутации протоонкогена RET (10q11.2) [3]. Соматические точковые мутации в этом гене часто находят в спорадических МКЩЖ [4]. Папиллярная карцинома (ПКЩЖ) – дифференцированный рак, обнаруживаемый примерно у 80% больных злокачественными новообразованиями щитовидной железы [5]. Доля семейных случаев ПКЩЖ составляет менее 5% [6]. Различные хромосомные перестройки протоонкогена RET (инверсии итранслокации) представляют частые генетические альтерации в спорадических ПКЩЖ [5].

В очень редких случаях МКЩЖ и ПКЩЖ, четко отличающиеся по распространенности, клеточному происхождению, гистопатологическим особенностям, методам лечения и прогнозу, могут независимо сосуществовать в щитовидной железе и/или в регионарных лимфатических узлах шеи одного больного. При этом они могут быть отделены друг от друга нормальной тканью щитовидной железы (coincidental tumors) или расположены рядом и даже частично перемешаны (collision tumors или composite tumors). Их следует отличать от истинно смешанных (true mixed) медуллярно-папиллярных тиреоидных опухолей, которые состоят из одной популяции злокачественных клеток, обладающих морфологическими и иммуногистохимическими свойствами как фолликулярных, так и парафолликулярных клеток на всех участках новообразования [7]. С начала 80-х годов прошлого века до недавнего времени в литературе было известно около 40 cлучаев ассоциации гистологически независимых МКЩЖ и ПКЩЖ, описанных как case reports. 19 из них, включая три собственные находки, процитированы в работе S. Rossi исоавт. [8]. В последнее время наряду с частными сообщениями [9–14] появились результаты ретроспективных исследований различных групп больных как МКЩЖ, так и ПКЩЖ, которые показали, что распространенность ассоциированных МКЩЖ/ПКЩЖ существенно выше, чем предполагали раньше [15–18]. Так, при исследовании серии медуллярных тиреоидных карцином больных из Германии доля сопутствующих папиллярных карцином щитовидной железы составила 3,6% (26/727) [18]. Столь резкое увеличение бинарных раков щитовидной железы объясняют более тщательными гистопатологическими исследованиями, а также влиянием факторов окружающей среды [18–21]. ПКЩЖ в большинстве описанных случаев представлена микрокарциномой [15, 16]. МКЩЖ в ассоциации с ПКЩЖ встречается как в спорадической, так и в наследственной формах. При этом гистогенетическое происхождение и возможные молекулярные механизмы, приводящие к образованию ассоциированных МКЩЖ и ПКЩЖ, совершенно не известны.

Мы впервые представляем описание больного с бинарным (синхронным) раком щитовидной железы (МКЩЖ/ПКЩЖ), выявленным в метастазах шейных лимфоузлов, и с редкой герминальной мутацией в кодоне 918 (экзон16) протоонкогена RET.

Клинический случай

Медицинский и семейный анамнез

У больного в возрасте 58 лет был диагностирован многоузловой зоб с явлениями компрессии органов шеи (по результатам тонкоигольной аспирационной биопсии – аденоматозный зоб). Родословная, со слов больного, эндокринными заболеваниями не отягощена. Была проведена тиреоидэктомия. При интраоперационном срочном гистологическом исследовании диагностирован мультицентричный папиллярный рак щитовидной железы. Результат гистологического исследования: двусторонний папиллярный рак (фолликулярный тип) с максимальными размерами опухолей справа – 4,5 см, слева – 5 см. Окончательный диагноз: папиллярный рак щитовидной железы III стадии T3N0M0. Больному была назначена супрессивная терапия тироксином.

Через 4 года при очередной плановой проверке больной пожаловался на головную боль и головокружение. При МРТ головного мозга была обнаружена аденома гипофиза. Кроме того, у него была выявлена массивная левосторонняя шейная лимфаденопатия. При цитологическом исследовании выявлены метастазы рака щитовидной железы в лимфоузлы слева. Была выполнена повторная операция: центральная шейная лимфодиссекция + селективная шейная диссекция слева + удаление лимфоузлов верхнего средостения (удаление клетчатки 2, 3, 4, 5, 6, 7-й зон шеи). Во всех зонах клетчатки шеи, включая ложе бывшей левой доли, центральную зону шеи и верхнее средостение до подключичной артерии, был обширный метастатический процесс. Окончательное гистологическое заключение: во всех удаленных лимфоузлах шеи, наряду с папиллярным раком и даже значительно преобладая, присутствует опухоль, содержащая амилоид, дающая положительные иммуногистохимические реакции на кальцитонин и хромогранин. Окончательный диагноз: бинарный (папиллярный и медуллярный) рак щитовидной железы III стадии pT3N0M0 (тиреоидэктомия проведена 4 года назад), прогрессирование: метастазы в лимфоузлы шеи и верхнего средостения, клиническая группа II. Сопутствующий диагноз: аденома гипофиза без признаков гормональной активности.

После операции состояние больного удовлетворительное. Уровень кальцитонина перед операциями не определяли. Кальцитонин через 4 мес после второй операции – 20 пг/мл при норме 2–6 пг/мл. У старшего сына пробанда (37 лет) уровень кальцитонина без стимулирования – 5,9 пг/мл. У больного и его старшего сына были исключены клинические и биохимические признаки поражения надпочечников и паращитовидных желез.

Методика генетического исследования

Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови с помощью набора QIAamp DNA Blood Mini Kit фирмы Qiagen (Германия) согласно протоколу изготовителя.

Амплификацию исследуемых фрагментов ДНК проводили с помощью полимеразно-цепной реакции (ПЦР) на программируемом термоциклере “Teрцик” фирмы “ДНК-технология” (Россия), как описано ранее [22–24], с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров. За исключением экзона 10 дизайн всех праймеров выполнен в лаборатории ДНК-диагностики ФГБНУ “Медико-генетический научный центр”, синтез – в ЗАО “Евроген” (Москва).

Для очистки продуктов ПЦР, предназначенных для сиквенса, использовали набор QIAquick PCR Purification Kit фирмы Qiagen.

Определение нуклеотидных последовательностей шести экзонов гена RET проводили методом прямого автоматического секвенирования на аппарате 3130xI Genetic Analyzer фирмы Applied Biosystems в двух направлениях, используя те же праймеры, что и при ПЦР-амплификации. Полученные данные анализировали с помощью программы Chromas 2.4.1.

Рестрикцию продуктов ПЦР осуществляли с помощью эндонуклеазы FokI (New England Biolabs, США) в условиях, рекомендованных изготовителем. Кроме всех членов семьи пробанда рестрикционному анализу подверглиамплификаты экзона 16 гена RET для 100 здоровых неродственных индивидов. Анализ фрагментов ДНК проводили методом электрофореза в 6% полиакриламидных гелях после окрашивания их бромистым этидием.

Результаты генетического исследования

При анализе структуры протоонкогена RET в ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови больного, в экзонах 10, 11, 13–15 не было обнаружено никаких изменений нуклеотидной последовательности. В 3`-областиинтрона 14 выявлен единственный полиморфизм с.2608 – 24 G>A (rs2472737) в гомозиготном состоянии. Секвенирование экзона 16 неожиданно выявило в одной из хромосом больного замену A на G в положении 2752. Этатранзиция изменяет смысл кодона 918: ATG (Met)>GTG (Val) (p.M918V) (рисунок).

Секвенирование ДНК двух сыновей пробанда и его 96-летней матери показало, что только старший сын имеет такую же замену в экзоне 16 в гетерозиготном состоянии. ДНК отца пробанда была недоступна, так как он умер в возрасте 66 лет от рака желудка. Поэтому можно только предполагать, что больной либо получил мутацию от отца, либо она возникла de novo.

Рестрикционный анализ экзона 16 гена RET больного с помощью эндонуклеазы FokI подтвердил наличие гетерозиготной замены в кодоне 918. Мутация в одной из хромосом элиминирует единственный сайт рестрикции для нуклеазы FokI, и на электрофореграмме выявляли фрагменты размером 184, 94 и 90 пар нуклеотидов (п.н.). В нормальных контролях (изучено 200 хромосом здоровых доноров) в ходе рестрикционного анализа обнаружено полное переваривание продуктов ПЦР с образованием фрагментов размером 94 и 90 п.н.

Уникальность этого сообщения заключается в том, что, во-первых, у нашего пациента в лимфатических узлах шеи были выявлены метастазы папиллярной и медуллярной карцином щитовидной железы без обнаружения последней в самой щитовидной железе. Во-вторых, в лимфоцитах периферической крови нашего пациента мы выявили редкую замену A>G в положении 2752 (кодон 918) в гетерозиготном состоянии, по-видимомуассоциированную с поздней манифестацией МКЩЖ. В-третьих, первичная папиллярная опухоль щитовидной железы у нашего больного – не микрокарцинома, как бывает в большинстве описанных в литературе случаев ассоциации МКЩЖ/ПКЩЖ, а большая билатеральная мультифокусная ПКЩЖ. И в-четвертых, у исследованного нами пациента имеет место сопутствующий диагноз: аденома гипофиза без признаков гормональной активности.

Обсуждение

Смесь метастазов медуллярной и папиллярной тиреоидных карцином (коллизионных метастазов) в лимфоузлах шеи является общей особенностью больных с бинарными МКЩЖ/ПКЩЖ раками щитовидной железы [10, 13, 25–28]. Невыявление МКЩЖ в резецированной щитовидной железе нашего больного как при первичном иммуногистохимическом анализе, так и при ретроспективном исследовании, возможно, объясняется наличием у него оккультной медуллярной тиреоидной опухоли (клинически не распознанная первичная опухоль). Известно, что даже микроскопическая МКЩЖ может быть довольно агрессивной и метастазирует примерно у 5% больных [29]. В таком случае различные антигенные характеристики клеток в метастазах лимфоузлов шеи свидетельствуют о независимом происхождении папиллярной карциномы и предполагаемой оккультной медуллярной карциномы в щитовидной железе нашего больного с редкой герминальной мутацией p.M918V в протоонкогене RET. Эта замена не была выявлена нами раньше при исследовании 64 российских семей с наследственной МКЩЖ. При обследовании нами 100 здоровых доноров мутация p.M918V также не обнаружена. Впервые она была описана итальянскими исследователями в 2010 г. в двух из 250 семей с наследственной МКЩЖ [30]. Аналогичным образом при исследовании 100 здоровых индивидов итальянские ученые также не выявили у них мутацию p.M918V, что подтверждает клиническую значимость этой замены, ассоциированной в итальянских семьях с семейной МКЩЖ, а у нашего пробанда – с наследственным медуллярным раком щитовидной железы с редкой ассоциацией с ПКЩЖ. В опытах in vitro, проведенных параллельно с анализом in silico, была показана низкая трансформирующая способность мутации p.M918V по сравнению с мутациями p.C634R и p.M918T гена RET [31], на основании чего она была отнесена к группе слабо активирующих герминальных мутаций (АТА класс A) [32]. Тем не менее течение МКЩЖ у большого числа носителей мутации p.M918V пока что не изучено.

Известно, что среди наследственных форм МКЩЖ наиболее агрессивное ее поведение характерно для синдрома МЭН 2Б (высокая пенетрантность, ранняя манифестация, инфильтрация в окружающие ткани, раннее метастазирование, наличие ко времени диагноза отдаленных метастазов, максимальное поражение лимфатических узлов), а относительно мягкое (довольно частая поздняя манифестация заболевания, неполная пенетрантность, отсутствие дистальных метастазов, отсутствие других эндокринных неоплазий) – для семейной МКЩЖ [33]. В нашем случае пробанд был абсолютно здоров до 58 лет. При росте 190 см весил 125 кг. Всю жизнь проработал шофером. Поздняя манифестация заболевания, отсутствие признаков феохромоцитомы и гиперплазии околощитовидных желез, а также клинического фенотипа, ассоциированного с МЭН 2Б (набор офтальмологических и скелетно-мышечных аномалий, невриномы слизистых, ганглионейроматоз кишечника и др.), указывают на возможность изолированной семейной МКЩЖ у нашего больного с герминальной заменой p.M918V в гене RET.

До недавних пор была известна только одна мутация в этом кодоне: р.М918Т. Среди всех RET-мутаций она обладает самой высокой пенетрантностью in vivo, очень высокой трансформирующей активностью in vitro и относится к группе наивысшего риска (ATA класс D) [32, 34]. Ее обнаруживают как герминальную или как мутацию de novo у 95% больных с синдромом МЭН 2Б, а также как самую частую соматическую RET-мутацию вспорадических МКЩЖ [3, 4, 34]. Такое существенное влияние доминантной мутации р.М918Т на функцию RET-рецептора объясняют ее исключительным положением в субстрат-связывающем кармане каталитического ядра [35, 36]. Замена высококонсервативного Met918 на треонин необратимо приводит к таким локальным конформационным изменениям белка RET в результате внедрения полярной аминокислоты, которые вызывают частичную утрату способности киназы к самоингибированию, т.е. к нарушению равновесного баланса между активной и неактивной формами фермента [37, 38]. По-видимому, мутации с наибольшей онкогенной активностью оказывают наибольший дестабилизирующий эффект на структуру неактивной формы киназы RET [38]. При этом у белков, содержащих мутацию p.М918Т, наблюдается конститутивная активация, независимая от связывания с лигандом[37]. Менее драматичный характер выявленной нами транзиции p.M918V, очевидно, объясняется тем фактом, что валин, как и метионин, является гидрофобной аминокислотой и его влияние на структуру гидрофобного субстрат-связывающего кармана не столь радикально, как в случае с гидрофильным (полярным) остатком треонина. Тем не менее эта замена обнаружена в трех неродственных семьях, отягощенных по МКЩЖ, т.е. сегрегируетс заболеванием и, следовательно, обладает онкогенным потенциалом. Мутация отсутствует у клинически здоровых родственников из этих семей, а также в выборках здоровых неродственных доноров (n1 = 100, n2 = 100) [30, настоящая статья].

Что же касается участия мутации p.M918V в патогенезе ПКЩЖ, то об этом ничего не известно. С одной стороны, в ряде работ было установлено, что активирующие герминальные RET-мутации косегрегируют с ПКЩЖ и, следовательно, играют важную роль в образовании не только МКЩЖ, но также и папиллярной карциномы, по крайней мере в некоторых родословных у части носителей RET-мутаций с клиникой семейной МКЩЖ или МЭН 2А [8, 9, 18, 39–41]. Эти данные получили частичное объяснение в опытах in vitro [41]. С другой стороны, больные, являющиеся носителями герминальных RET-мутаций, довольно редко поражаются бинарными раками щитовидной железы. В таблице приведены известные сегодня герминальные мутации гена RET, выявленные у больных с МКЩЖ/ПКЩЖ. В основном это нецистеиновые мутации, локализованные в тирозинкиназном субдомене белка (экзоны 13, 14, 15) в кодонах 790, 804 и 891. Они относятся к классу слабопатогенных мутаций, ассоциированных с поздней манифестацией МКЩЖ, сниженной пенетрантностью заболевания и обладающих низкой трансформирующей активностью in vitro [30, 32]. Их обнаружение при бинарных (синхронных) МКЩЖ/ПКЩЖ раках щитовидной железы можно объяснить тем фактом, что носители этих нецистеиновых мутаций, как правило, оперируются существенно позже (в возрасте 30–50 лет) [42, 43], чем носители сильно патогенных RET-мутаций. И этот факт может способствовать развитию сопутствующей гистологически отличной опухоли.

Наше сообщение наряду с другими работами, посвященными сравнительно редким бинарным ракам щитовидной железы, является ярким примером того, насколько важна своевременная дифференциальная диагностика узлов щитовидной железы, особенно у больных с наследственной МКЩЖ, поскольку выбор тактики хирургического лечения и объем операционного вмешательства в таких случаях определяются в первую очередь медуллярным компонентом. Известно, что МКЩЖ – более агрессивный тип рака щитовидной железы. Она гораздо труднее поддается лечению, чем ПКЩЖ, и имеет гораздо более высокие уровни рецидивов и смертности [5, 44]. Поэтому рутинный скрининг сывороточного кальцитонина у всех больных с узлами щитовидной железы, на наш взгляд, мог бы способствовать выявлению оккультных МКЩЖ и, следовательно, их более оптимальной (адекватной) тактике лечения и дальнейшего наблюдения.

Заключение

У больного с редким коллизионным раком в метастазах лимфоузлов шеи (ПКЩЖ и МКЩЖ, без обнаружения первичной медуллярной опухоли) выявлена редкая герминальная мутация p.M918V в протоонкогене RET. Предположение о присутствии оккультной МКЩЖ у больного оставляет открытой возможность семейного медуллярного рака щитовидной железы с редкой ассоциацией с ПКЩЖ.

Информация о финансировании и конфликте интересов

Работа не получала никаких внебюджетных финансирований.

Все авторы не имеют ни потенциальных, ни явных конфликтов интересов, связанных с данной рукописью.

Cогласие пациента на публикацию данной рукописи получено.