Анализ ассоциаций полиморфизма генов-кандидатов аутоиммунных заболеваний у лиц с семейными случаями диффузного токсического зоба и аутоиммунного тиреоидита

Обоснование

В основе развития аутоиммунных заболеваний (АИЗ) щитовидной железы (ЩЖ) лежит взаимодействие генетических факторов и триггеров окружающей среды, что приводит к ускользанию от механизма собственной иммунологической толерантности [1]. Косвенным подтверждением существования генетического компонента является высокая распространенность семейных случаев АИЗ ЩЖ, которая может быть выявлена в каждом третьем случае [2]. Различные исследовательские группы в течение многих лет неоднократно показывали, что лица с отягощенным семейным анамнезом по заболеваниям ЩЖ имеют больший риск возникновения данной патологии. T.H. Brix и соавт. оценили величину генетического компонента в развитии АИЗ ЩЖ, равную 75% [3]. Работы, связанные с полногеномным скринингом, позволили установить гены-кандидаты, предрасполагающие к развитию АИЗ ЩЖ, которые можно разделить на три типа: тиреоидспецифические гены, гены системы HLA, не-HLA иммунорегуляторные гены [4]. К последней группе относятся гены CTLA4, PTPN22 [5]. При сравнительном анализе половозрастных и основных клинико-лабораторных характеристик пациентов с АИЗ ЩЖ г. Новосибирска определено, что у каждого третьего пациента имеется отягощенный наследственный анамнез по заболеваниям ЩЖ: среди лиц с диффузным токсическим зобом (ДТЗ) – 30%, у пациентов с аутоиммунным тиреоидитом (АИТ) – 44%. Выявлена связь носительства аллеля G и генотипа GG полиморфизма A49G гена CTLA4 с повышенным риском развития ДТЗ у мужчин [6]. Носительство аллеля T полиморфизма C1858T гена PTPN22 у женщин ассоциировано с повышенным риском развития АИТ [7].

Таким образом, полученные ранее данные о семейной агрегации заболеваний ЩЖ, выявленные ассоциации полиморфизма A49G гена CTLA4 с повышенным риском развития ДТЗ, полиморфизма C1858T гена PTPN22 с АИТ, отсутствие в отечественной литературе работ, посвященных изучению генетических факторов семейных случаев АИЗ ЩЖ, обусловили проведение данного исследования.

Цель

Изучить связь полиморфизма некоторых генов иммунного ответа с семейными случаями АИЗ ЩЖ.

Методы

Исследование одобрено этическим комитетом ФГБНУ “НИИ терапии и профилактической медицины”, протокол № 42 от 18.12.2012. Обследовано 49 семей, в которых члены семей первой линии родства имели АИЗ ЩЖ (АИТ или ДТЗ). Критерии включения в группу семейных случаев АИЗ ЩЖ: 1) подписание информированного согласия; 2) АИТ (с манифестным гипотиреозом) или ДТЗ; 3) наличие члена семьи первой степени родства с диагностированным АИТ или ДТЗ. Критерии исключения из группы семейных случаев АИЗ ЩЖ: 1) диагностированный узловой, диффузный эутиреоидный зоб, послеоперационный гипотиреоз, развившийся вследствие оперативного лечения узлового зоба, рака ЩЖ; 2) диагностированный подострый, послеродовый тиреоидит, субклинический гипотиреоз и субклинический тиреотоксикоз; 3) прием лекарственных препаратов, которые могут нарушать функцию ЩЖ, – содержащих йод в фармакологических дозах (амиодарон, рентгеноконтрастные соединения), интерферонов, препаратов лития.

Диагноз АИТ (с манифестным гипотиреозом) устанавливали на основании характерных жалоб, данных анамнеза, повышения уровня тиреотропного гормона (ТТГ) и снижения уровня тироксина (св.Т4) в случае сочетания классической ультразвуковой картины АИТ (снижение эхогенности или изменение структуры за счет гипоэхогенных очагов различной формы и размеров на фоне нормальной эхогенности) с повышенным уровнем антител к тиреоидной пероксидазе (АТ-ТПО).

Диагноз ДТЗ устанавливался на основании характерных жалоб, данных анамнеза, клинических симптомов тиреотоксикоза, диффузного увеличения ЩЖ, повышенного уровня св.Т4 наряду со снижением уровня ТТГ ниже 0,1 мЕд/л, повышением уровня антител к рецептору ТТГ. По данным ультразвукового ислледования (УЗИ) учитывались увеличение объема ЩЖ, низкая эхогенность, неоднородность эхоструктуры ткани ЩЖ. Кроме того, фиксировались сочетания ДТЗ с эндокринной офтальмопатией. При необходимости выполнялась радиоизотопная сцинтиграфия с 99mТс-пертехнетатом.

76 человек составили группу контроля. Данная группа сформирована из лиц, обследованных в скрининг-центре “НИИТПМ” в рамках эпидемиологического международного исследования HAPIEE. Проект поддержан грантами фонда WellcomTrust (064947/Z/01/Z и WT 081081 AIA) и Национального института возраста США (1 R01 AG23522-01) (2002–2006 гг.) (главные исследователи в Новосибирске – академик РАН Никитин Ю.П. и профессор Малютина С.К.). В проекте HAPIEE обследовалась репрезентативная выборка населения г. Новосибирска 45–69 лет, обследовано более 9000 человек. Из этого числа случайным образом выбрано 280 человек, которым проведено определение ТТГ, св.Т4, АТ-ТПО, выполнено УЗИ ЩЖ. Для генетического анализа в группу сравнения выбрали образцы ДНК 76 человек, сопоставимых по полу, у которых по результатам обследования, анамнезу были исключены любые заболевания ЩЖ. Кроме того, все лица в группе контроля отрицали наличие члена семьи с любым диагностированным заболеванием ЩЖ.

Определение объема ЩЖ и ее эхоструктуры проводилось с помощью ультразвукового исследования на аппарате ALOKA-SSD-1100 датчиком 9 МГц.

Определение гормонов тиреоидной группы, АТ-ТПО проведено в лаборатории клинических биохимических и гормональных исследований терапевтических заболеваний “НИИТПМ” (руководитель – д.м.н., профессор РАН Рагино Ю.И.). Определение показателей ТТГ, св.Т4, АТ-ТПО проведено иммуноферментным методом с использованием коммерческих тест-систем. Границы условно-нормальных лабораторных показателей были взяты из инструкций использованных наборов: для базального уровня ТТГ – 0,167–4,05 мЕд/л, для св.Т4 – 10,0–26,0 пмоль/л, для АТ-ТПО – <30 Ед/мл.

Молекулярно-генетические исследования выполнены на базе лаборатории молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний “НИИТПМ” (руководитель – д.м.н., доцент Максимов В.Н.). В нем приняли участие 70 пациентов (35 семей) с семейными случаями АИЗ ЩЖ и все лица из группы контроля. Выделение ДНК из крови проводилось методом фенол-хлороформной экстракции по модифицированной методике [8]. Генотипирование полиморфизма A49G в первом экзонe гена CTLA4 проводили с помощью полимеразно-цепной реакции (ПЦР) с последующим расщеплением ПЦР продукта эндонуклеазой рестрикции PspEI (“СибЭнзим”, г. Новосибирск). Для амплификации нужного фрагмента ДНК длиной 153 п.н. были использованы праймеры: 5` - AAGGC-TCAGC-TGAAC-CTGGT - 3` – прямой праймер; 5`- CTGCT-GAAAC-AAATG-AAACC-C - 3` – обратный праймер [9]. Детекцию полиморфизмаC1858T в гене PTPN22 проводили с помощью ПЦР с последующим ПДРФ-анализом. Для этого использовали эндонуклеазу рестрикции RsaI (“СибЭнзим”, г. Новосибирск). Для амплификации нужного фрагмента ДНК длиной 252 п.н. использовались праймеры: 5` - CCATC-CCACA-CTTTA-TTTTA-TACT -3` – прямой праймер; 5`- GATAA-TGTTG-CTTCA-ACGGA-ATTT -3` – обратный праймер. Результаты рестрикции всех трех продуктов оценивали с помощью электрофореза в 4% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием.

Статистическая обработка: результаты исследований для количественных признаков представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха (25-й квартиль (Q1); 75-й квартиль (Q3)), качественные признаки представлены в виде абсолютных значений и процентных долей. Статистический анализ включал проверку характера распределения показателей. При наличии распределения, отличного от нормального, использовался непараметрический метод (тест Манна–Уитни для двух независимых выборок); различие пропорций и оценку соответствия частот генотипов равновесию Харди–Вайнберга проводили с использованием критерия c2. Относительный риск развития заболевания оценивали с помощью показателя отношения шансов (ОШ). ОШ = 1 рассматривали как отсутствие ассоциации, ОШ > 1 – как фактор повышенного риска развития заболевания, ОШ < 1 – как фактор пониженного риска развития заболевания. Для всех статистических расчетов уровень p-value <0,05 считался статистически значимым.

Результаты

Обследовано 100 человек (9 мужчин и 91 женщина) с АИЗ ЩЖ из 49 семей. В 11 семьях (22,5%) АИЗ ЩЖ прослеживались на протяжении одного поколения (среди сибсов), медиана возраста в данной подгруппе составила 29 [24; 41] лет, в 38 семьях (77,5%) – среди двух поколений (родитель–потомок). Пациенты последней группы были разделены на две подгруппы: старшего и младшего поколения, куда вошли родители (медиана возраста 58 [51; 65] лет) и потомки (медиана возраста 30 [26; 39] лет). В структуре патологии доля лиц с ДТЗ среди всех пациентов составила 34% (34 человек), с АИТ – 66% (66 человек). Семейные случаи с ДТЗ у обоих членов семьи составили 24% (12 семей), с АИТ у обоих членов семьи – 56% (27 семей), в 20% (9 семей) имели место оба заболевания. Также в исследование была включена одна семья, в которой заболевание прослеживалось у обоих родителей и потомка: супруги имели АИТ и ДТЗ, в то время как у потомка был диагностирован АИТ. Среди сибсов 55% (6 семей) имели АИТ у обоих родственников, 9% (1 семья) – ДТЗ, в 36% (4 семьи) были диагностированы оба заболевания. В подгруппе “родители–потомки” структура АИЗ ЩЖ выглядела следующим образом: у 55% семей имел место АИТ у обоих родственников (21 семья), у 26% (10 семей) – ДТЗ у родителя и потомка, в 19% (7 семей) были установлены оба заболевания. Клинико-лабораторные характеристики пациентов групп сравнения подробно представлены в опубликованной ранее работе авторов [10].

Таким образом, среди семейных случаев АИЗ ЩЖ преобладали пары с АИТ как в подгруппе родителей–потомков, так и среди сибсов. Данные результаты согласуются с высокой распространенностью АИТ в популяции, которая существенно превышает частоту ДТЗ. Так, в исследовании M.P. Vanderpump и соавт. было показано, что распространенность АИТ увеличивается с возрастом и составляет от 4 до 21% у женщин и от 3 до 16% у мужчин [11]. АИТ является причиной 70–80% всех случаев первичного гипотиреоза [12]. Гиперфункция ЩЖ определяется у 2% женщин, среди мужчин данное состояние встречается приблизительно в 10 раз реже [13].

Группу пациентов с семейными случаями АИЗ ЩЖ, для которых было проведено генетическое исследование, составили 70 пациентов (7 мужчин и 63 женщины) с АИТ или ДТЗ из 35 семей. Эти пациенты подписали информированное согласие на проведение генетического анализа. В группу сравнения (76 человек: 8 мужчин и 68 женщин) были включены лица, сопоставимые по полу, но более старшего возраста, чем в группе пациентов с семейными случаями АИЗ ЩЖ. Включение в группу сравнения лиц старшего возраста не является препятствием в генетическом исследовании, поскольку у них более вероятны фенотипические проявления заболеваний ЩЖ.

Ген CTLA4 кодирует трансмембранный регуляторный белок, который экспрессируется на активированных Т-клетках и негативно регулирует их функцию. CTLA4 конкурирует с CD28 за связывание с его лигандом В7 на АПК, повышает порог активации Т-клеток и тем самым является необходимым посредником для стабильного взаимодействия Т-клеток и АПК. В ряде исследований на европеоидной и азиатской популяции была показана связь однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) A49G гена CTLA4 с выработкой антител к компонентам ткани ЩЖ, восприимчивостью к ДТЗ и АИТ [14, 15]. В настоящем исследовании не получено различий в распределении частот генотипов полиморфизма A49G гена CTLA4 у лиц с ДТЗ или АИТ – членов семей с АИЗ ЩЖ по сравнению с группой контроля (табл. 1).

Отдельно среди мужчин анализ не проводился, так как всего их было 7 человек с АИЗ ЩЖ.

По данным проведенных ранее исследований в г. Новосибирске, у мужчин носительство аллеля G и генотипа GG полиморфизма A49G гена CTLA4 ассоциировано с повышенным риском развития ДТЗ, у женщин такой связи не было обнаружено [7].

У больных АИТ, как по данным других исследований на популяции города Новосибирска, так и по результатам настоящего исследования, не обнаружено гендерных различий в частоте генотипов и аллелей полиморфизма A49G гена CTLA4 по сравнению с контрольной группой.

При изучении частот генотипов и аллелей в зависимости от степени родства значимых отличий выявлено не было (табл. 2).

W.-H. Ting и соавт. изучили частоту полиморфизма A49G гена CTLA4 среди более чем 250 взрослых пациентов с ДТЗ и среди аналогичного количества детей с данным заболеванием. Авторы так же, как и в настоящем исследовании, не выявили существенных различий между пациентами старшей и младшей возрастных групп [16].

Ген PTPN22 кодирует лимфоцитарную тирозинфосфатазу, которая является отрицательным регулятором Т-клеточной активации. Предполагается, что снижение супрессии Т-клеток приводит к активации в отношении аутоантигенов, что позволяет Т-клеткам уклониться от классического механизма толерантности [17]. Ранее среди жителей г. Новосибирска с ДТЗ, как среди мужчин, так и женщин, не было выявлено разницы в частоте генотипов и аллелей полиморфизма C1858T гена PTPN22 по сравнению с группой контроля. Было установлено преобладание в группе пациентов с АИТ гомозиготного генотипа TT и аллеля T полиморфизма C1858T гена PTPN22 по сравнению с группой здоровых. Носительство аллеля T у женщин было ассоциировано с повышенным риском развития АИТ [6]. Аналогичные данные о связи данного ОНП с АИТ были получены среди жителей Центральной Европы [18].

В настоящем исследовании гомозиготный генотип TT полиморфизма С1858Т гена PTPN22 был обнаружен только у женщин с АИЗ ЩЖ (табл. 3).

Все носители генотипа TT имели ДТЗ – 12% от всех случаев данного заболевания (табл. 4). Кроме того, в группе пациентов c ДТЗ отмечалось достоверно меньшее накопление гомозигот СС(58 против 79% в группе контроля, р = 0,047).

Носительство аллеля Т определялось чаще в группе с семейными случаями ДТЗ по сравнению с группой контроля (27 против 11% соответственно). Данные отличия были достоверными (c2= 8,066, р = 0,005). Носительство аллеля Т ассоциировано с повышенным риском ДТЗ (ОШ = 3,18; 95% ДИ 1,39–7,17).

Небольшое количество пациентов мужского пола с семейными случаями ДТЗ, вошедших в исследование, не позволило провести статистическое сравнение частот генотипов с группой контроля.

Гомозиготный генотип ТТ обнаружен только в группе женщин с ДТЗ (14% всех случаев данного заболевания). Частота гомозиготного генотипа СС была незначимо выше в группе контроля (78 против 59% в группе женщин с ДТЗ, р = 0,088). В группе пациенток с ДТЗ достоверно более часто встречалось носительство аллеля Т по сравнению с контролем (29 и 11% соответственно,c2 = 8,107, р = 0,004). Носительство аллеля Т ассоциировано с повышенным риском семейных случаев ДТЗ среди женщин (ОШ = 3,34; 95% ДИ 1,41–7,89).

У лиц с АИТ гетерозиготный генотип СТ полиморфизма С1858Т гена PTPN22 определялся чаще, чем в группе контроля (39 и 21% соответственно, р = 0,033) (табл. 4). Частота носительства гомозиготного генотипа СС в группе контроля была выше, чем в группе пациентов с семейными случаями АИТ (79 против 61% соответственно, р = 0,033). Носительство гетерозиготного генотипа СТ было ассоциировано с риском развития семейных случаев АИТ по сравнению с носительством гомозиготного генотипа СС (р = 0,031; ОШ = 2,41; 95% ДИ 1,07–5,41). Носительство аллеля Т определялось чаще в группе с семейными случаями АИТ по сравнению с группой контроля (20 против 11%, р = 0,050), однако достоверной ассоциации с риском развития АИТ получено не было (ОШ = 2,07; 95% ДИ 0,99–4,29).

В подгруппе женщин с АИТ определялись те же тенденции, что и в объединенной группе лиц с АИТ обоих полов. В данный подгруппе гомозиготный генотип СС определялся реже, чем в группе контроля (63 и 78% соответственно, р = 0,056), однако полученные отличия были незначимыми. Небольшое количество пациентов мужского пола с семейными случаями АИТ, вошедших в исследование, не позволило провести статистическое сравнение частот генотипов с группой контроля.

В подгруппе родителей имело место накопление гомозиготного генотипа ТТ среди пациентов с АИЗ ЩЖ по сравнению с группой контроля (4% против 0% соответственно). Более подробная информация приведена в табл. 5. Не было получено отличий по частоте носительства генотипа СТ в подгруппах сибсов и родителей с семейными случаями АИЗ ЩЖ по сравнению с группой контроля (25 и 24% против 21% соответственно). В подгруппе потомков с АИЗ ЩЖ было установлено достоверное преобладание носительства гетерозиготного генотипа СТ по сравнению с группой контроля (64 и 21% соответственно, р = 0,001). Кроме того, частота носительства гомозиготного генотипа СС была ниже в группе потомков с АИЗ ЩЖ по сравнению с группой контроля (28 и 79% соответственно). Полученные данные были статистически достоверны (р = 0,001). Носительство генотипа СТ ассоциировано с риском развития семейных случаев АИЗ ЩЖ в группе потомков (ОШ = 6,96; 95% ДИ 2,39–20,34). Установлено увеличение частоты носительства аллеля Т в данной подгруппе пациентов по сравнению с группой контроля (c2 = 35,813, р = 0,001). Носительство аллеля Т ассоциировано с риском развития АИЗ ЩЖ в группе потомков (ОШ = 8,19; 95% ДИ 3,88–17,28). Среди потомков женского пола установлено, что носительство аллеля Т ассоциировано с риском развития АИЗ ЩЖ (ОШ = 3,18; 95% ДИ 1,42–7,26).

Частота носительства аллеля Т не отличалась между сибсами, родителями и контрольной группой женского пола (13, 15% против 11% соответственно).

Малый объем выборки мужчин не позволил оценить исследуемые параметры в группе сибсов, потомков и родителей по сравнению с контролем. Более подробная информация приведена в табл. 5.

В данном исследовании был применен ассоциативный анализ в отношении изучения вклада ОНП двух иммунорегуляторных генов – CTLA4 и PTPN22. Ассоциативный анализ – это высокочувствительный метод, позволяющий определить гены, имеющие вклад менее 5% от общего генетического вклада в развитие заболевания. На основании полученных результатов можно утверждать, что пациенты с семейными случаями АИЗ ЩЖ являются высокоинформативной моделью для изучения вклада генетических факторов. Так, на китайской популяции при исследовании частоты различных вариантов гена HLA-DRB1 среди 58 пациентов с АИТ и их родителей, а также среди 75 пациентов с данным заболеванием и их братьев/сестер была установлена ассоциация HLA-B*46:01 с предрасположенностью к АИТ в данной группе пациентов [19]. В ряде работ в качестве объекта выбирается только одна родословная. Так, в исследование, проведенное в Тунисе, было включено более 400 человек, принадлежащих одной родословной. Данная семья наблюдалась в течение 20 лет, всего в нее вошло 78 пациентов с АИЗ ЩЖ. На данной группе была показана ассоциация полиморфизмов генов PTPN22, тиреоглобулина, рецептора витамина D с развитием заболевания. Также были получены свидетельства в пользу взаимодействия генов. Наиболее значимая связь была обнаружена между упомянутыми выше генами и областью, кодирующей белки основного комплекса гистосовместимости [20].

Ранее среди жителей города Новосибирска нами были получены данные, что носительство генотипов СT и TT полиморфизма С(-1)Т гена СD40 ассоциировано с уменьшением риска развития семейных форм ДТЗ вне зависимости от степени родства (ОШ = 0,20; 95% ДИ 0,08–0,45). При АИТ ассоциаций полиморфизма С(-1)Т гена СD40 выявлено не было. Носительство аллеля С ассоциировано с повышенным риском развития семейных случаев ДТЗ (ОШ = 2,63; 95% ДИ 1,21–5,64), но не АИТ. Выявленные различия в частоте носительства аллеля С между группами сибсов и контролем (ОШ = 2,52; 95% ДИ 1,07–5,95), а также между группой матерей и контролем (ОШ = 2,44; 95% ДИ 1,156–4,98) позволили сделать вывод о возможности применения исследования полиморфизма С(-1)Т гена CD40 в качестве прогностического фактора. Так, при наличии брата или сестры с АИЗ ЩЖ или при наличии потомка с АИЗ ЩЖ носительство у сибса или у матери аллеля С ассоциировано с возникновением семейных случаев данного заболевания [21].

Заключение

Среди семейных случаев АИЗ ЩЖ преобладали пациенты с хроническим АИТ с исходом в гипотиреоз – 66%. АИТ у родителя и потомка встречался в 55% семей. В группе сибсов АИТ имел место у обоих родственников в 54% семей.

Не получено различий в распределении частот генотипов полиморфизма A49G гена CTLA4 у пациентов с семейными случаями АИЗ ЩЖ по сравнению с группой контроля.

Носительство аллеля Т полиморфизма C1858T гена PTPN22 ассоциировано с риском развития АИЗ ЩЖ в группе потомков женского пола (ОШ = 3,175; 95% ДИ 1,423–7,262). Полученные результаты позволяют рекомендовать изучение данного полиморфизма для выявления пациенток группы риска.

Учитывая, что ДНК-тестирование на современном этапе является одним из главных звеньев персонифицированной медицины, результаты молекулярно-генетического исследования семейных случаев АИЗ ЩЖ создают предпосылки для оптимизации диагностики в семьях у данной категории пациентов.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа проведена при поддержке ФГБНУ “НИИ терапии и профилактической медицины” в рамках утвержденной темы научной работы. Представленный в статье материал является частью диссертационного исследования Пьянковой А.К. В представленной работе использовались данные из банка ДНК популяции Новосибирска, который был создан “НИИТПМ” в ходе выполнения международного проекта HAPIEE (главные исследователи в Новосибирске – академик РАН Никитин Ю.П. и профессор Малютина С.К.). Проект HAPIEE (Детерминанта сердечно-сосудистых заболеваний в Центральной и Восточной Европе: когортное исследование) поддержан грантами фонда WellcomTrust (064947/Z/01/Z и WT 081081 AIA) и Национального института возраста США (1 R01 AG23522-01) (2002–2006 гг.).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Информация о вкладе каждого автора

Рымар О.Д. – концепция и дизайн исследования, сбор материала (подбор когорты пациентов), окончательная оценка полученных данных, написание и редактирование текста рукописи; Пьянкова А.К. – анализ научной литературы по теме исследования, подбор когорты пациентов, сбор, подготовка препаратов ДНК, генотипирование, систематизация и обработка материала, оценка и анализ полученных данных, написание текста рукописи; Максимов В.Н. – концепция и дизайн исследования, помощь в проведении генотипирования, систематизация и статистическая обработка материала, редактирование текста рукописи; Мустафина С.В. – сбор материала (подбор группы контроля), Шахматов С.Г. – сбор материала (УЗИ ЩЖ), Щепина Ю.В. – сбор материала (УЗИ ЩЖ), Рябиков А.Н. – оценка полученных данных УЗИ ЩЖ.