МикроРНК – перспективные молекулярные маркеры обнаружения рака в узлах щитовидной железы

Введение

Одним из распространенных заболеваний щитовидной железы (ЩЖ) является узловой зоб. Это собирательное клиническое понятие, объединяющее различные по морфологии объемные образования ЩЖ, выявляемые с помощью пальпации и/или ультразвукового исследования (УЗИ). Распространенность узловых образований ЩЖ составляет от 2 до 65%, в зависимости от метода обнаружения [1]. На долю рака щитовидной железы (РЩЖ) по отношению к доброкачественным образованиям приходится от 5 до 10% [2]. Методом, который позволяет провести дифференциальный диагноз заболеваний и исключить злокачественную патологию ЩЖ, является тонкоигольная пункционная биопсия (ТАБ).

Цитологическая диагностика патологического процесса в ЩЖ базируется на совокупности определенных признаков. На результативность метода пункционной биопсии влияют следующие факторы: квалификация врача, производящего пункцию, квалификация врача-цитолога, соблюдение правильной техники изготовления мазков, количество полученного материала. По данным многочисленных исследований, чувствительность ТАБ в выявлении рака составляет 70–98% (в среднем около 80%), а специфичность – 70–100% (в среднем 92%) [3].

Несмотря на то что ТАБ считается достаточно точным методом диагностики, в 30% случаев заключение оказывается неопределенным, так как цитологических признаков оказывается недостаточно для определения доброкачественных и злокачественных опухолей. Цитологическое исследование пунктата узлового образования ЩЖ не позволяет надежно дифференцировать доброкачественную фолликулярную аденому от высокодифференцированного фолликулярного РЩЖ. В новом пересмотре международной цитологической классификации (Bethesda Thyroid Classification) от 2017 г. рекомендовано проведение молекулярно-генетических исследований в образцах с неопределенным цитологическим заключением [4]. Определение молекулярных маркеров в аспирате ЩЖ позволит более точно дифференцировать доброкачественные и злокачественные новообразования на дооперационном этапе и тем самым уменьшит количество нецелесообразных операций [5]. В последние годы появляется большое количество работ, посвященных изучению молекулярных маркеров, их идентификации, роли в дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных поражений ЩЖ [3, 5–7].

МикроРНК – молекулярные маркеры

Одним из молекулярных маркеров являются микроРНК. Это короткие (18–24 нуклеотида) молекулы, регулирующие экспрессию множества генов на посттранскрипционной стадии. Исследования показали, что зрелые микроРНК регулируют экспрессию примерно 10–30% всех человеческих генов [8]. Они участвуют в широком спектре процессов, включая апоптоз, пролиферацию, дифференцировку, ангиогенез, которые играют решающую роль в развитии канцерогенеза. Последние исследования показали, что микроРНК не только ассоциированы с различными типами опухолей, но могут сами выступать в роли онкогенов и супрессоров опухолей. При злокачественной трансформации всегда происходит изменение уровня экспрессии каких-либо микроРНК. Они достаточно стабильны и могут быть выявлены в различных биологических материалах, таких как плазма крови, моча, гистологическая ткань [9]. Таким образом, микроРНК представляют собой перспективные диагностические маркеры.

МикроРНК в диагностике рака щитовидной железы

В последнее время проведено большое количество исследований, связанных с измерениями уровня экспрессии микроРНК в опухолях ЩЖ (табл. 1). В исследовании, проведенном в Швейцарии, были проанализированы 52 образца ткани ЩЖ (17 образцов с диагнозом “фолликулярный вариант папиллярной карциномы ЩЖ” (ФВПКЩЖ), 21 образец с диагнозом ПКЩЖ, согласно гистологическому заключению, и 8 образцов с нормальной тканью ЩЖ). Исследование уровня экспрессии 748 микроРНК показало, что для следующих микроРНК: -146b-3р, -146-5р, -221, -222, -222-5р, -375, -551b, -181-2-3p, -99b-3p уровень экспрессии был повышен в образцах с диагнозом ПКЩЖ по сравнению с нормальной тканью ЩЖ. Снижен уровень экспрессии в злокачественных опухолях микроРНК-1179, -138, -144-5р, -199b-5р, -204, -219-5р, -451. Уровень экспрессии четырех микроРНК: -125a-3p, -1271, -153, -623 повышен более чем в 5 раз в образцах с диагнозом ФВПКЩЖ по сравнению с ПКЩЖ [10].

Таблица 1. МикроРНК, дифференциально экспрессирующиеся при РЩЖ: данные, полученные при гистологическом исследовании опухоли ЩЖ

Примечание. ↑/↓ – повышенный/сниженный уровень экспрессии микроРНК; ПКЩЖ – папиллярная карцинома щитовидной железы; ФКЩЖ – фолликулярная карцинома щитовидной железы; МКЩЖ – медуллярная карцинома щитовидной железы.

Согласно исследованию, проведенному в медицинском университете в г. Варшаве, экспериментальная выборка которого составила 42 препарата (ПКЩЖ, непораженная ткань ЩЖ, прилегающая к опухоли, доброкачественная ткань ЩЖ, по 14 препаратов в каждой группе соответственно) было обнаружено 427 микроРНК, экспрессия которых выражена в тканях ЩЖ, в том числе экспрессия 388 микроРНК повышена при ПКЩЖ. Экспрессия 396 микроРНК выражена в ткани ЩЖ, прилегающей к злокачественному образованию ЩЖ. Экспрессия 409 микроРНК выражена в нормальной ткани ЩЖ. Из общего числа микроРНК, которые были выражены как в доброкачественных, так и злокачественных опухолях ЩЖ, изменение экспрессии 124 микроРНК было более выражено в ПКЩЖ по сравнению с группой контроля (ткань ЩЖ без узлового образования). Список с наиболее выраженным изменением уровня экспрессии составили микроРНК-146b-5p, -221-3р, -551b-3р, -486-3р, -144-3р, -146b, -3р, -7-5p, -221-5р, -144-5p. Анализ показал, что 44 микроРНК имели разный уровень экспрессии при сравнении образцов с ПКЩЖ и непораженной тканью ЩЖ, прилегающей к опухоли, из них наиболее высокий уровень экспрессии характерен для микроРНК-146b-5p, -146b, -3р, а низкий уровень экспрессии – для микроРНК-1179, -7-2-3р [11].

В исследовании, проведенном в Испании на базе госпиталей Сан-Пау, Сабадель в Барселоне и Арнау-де-Виланова в Лерида, после получения информированного согласия от участников исследования осуществлялся набор послеоперационных препаратов ЩЖ. В общей сложности выборка состояла из 127 образцов ЩЖ, которые, согласно заключению патологоанатома, были распределены на следующие категории: фолликулярные аденомы (n = 26), ФКЩЖ (n = 23), ПКЩЖ (n = 78). Кроме того, было получено 17 препаратов с нормальной тканью ЩЖ от пациентов, которым была проведена гемитиреоидэктомия и которые подписали согласие на забор ткани ЩЖ из контралатеральной (здоровой) доли ЩЖ. Все препараты с диагнозом ПКЩЖ подвергались скринингу на мутацию BRAF. Препараты с диагнозом фолликулярной аденомы, ФКЩЖ, ФВПКЩЖ подвергались скринингу на мутации HRAS, NRAS, KRAS. В результате исследования были идентифицировано два основных профиля экспрессии микроРНК, характерных и для фолликулярной, и для папиллярной опухоли ЩЖ. В фолликулярной опухоли ЩЖ был повышен уровень экспрессии микроРНК-515 и снижен уровень экспрессии микроРНК-1247. Среди препаратов с диагнозом ПКЩЖ повышен уровень экспрессии микроРНК-146b, -221, -222, -21, -31, но снижен уровень экспрессии микроРНК-1179, -7, -204. Согласно полученным результатам, авторы данного исследования выявили как минимум две молекулы микроРНК-34а, -221, которые они относят к регуляторам канцерогенеза ЩЖ.

Роль микроРНК в развитии и прогрессировании медуллярной карциномы ЩЖ (МКЩЖ) изучена недостаточно. Только два исследования оценивали уровень экспрессии микроРНК при МКЩЖ. M.N. Nikiforova и соавт. в 2008 г. первые исследовали экспрессию микроРНК при МКЩЖ. В результате было установлено повышение уровня экспрессии микроРНК-10а и -375 при МКЩЖ по сравнению с доброкачественными образованиями ЩЖ. Кроме того, экспрессия микроРНК-375 ассоциировалась с более злокачественным течением, включая метастазирование в лимфатические узлы [28]. C. Mian и соавт. в 2012 г. подтвердили повышенную экспрессию микроРНК-375 как при МР, так и при С-клеточной гиперплазии [26, 29].

Кроме гистологического материала, количество микроРНК можно определять и в материале, полученном экстракцией с цитологических препаратов после проведения ТАБ (табл. 2). По результатам проведенного ретроспективного исследования R. Shen и соавт. [30], в которое вошли цитологические препараты (n = 510 в период с 2005 по 2010 г.), из которых 135 образцов имели гистологическое заключение, полностью соответствующее цитологическому, был отобран набор из 4 микроРНК (-146b, -221, -187 и -30d), с помощью которого можно с высокой точностью дифференцировать доброкачественные новообразования ЩЖ от злокачественных. Данные, полученные в этом исследовании, аналогичны результатам, полученным в других лабораториях. В исследовании M.N. Nikiforova и соавт. сообщается, что набор из семи микроРНК (-187, -221, -222, -146b, -155, -224 и -197) может быть использован в дифференциальной диагностике РЩЖ в дооперационных образцах после проведения ТАБ [28].

Таблица 2. МикроРНК, дифференциально экспрессирующиеся при РЩЖ: данные, полученные в цитологическом материале после проведения ТАБ

Примечание. ↑/↓ – повышенный/сниженный уровень экспрессии микроРНК. ПКЩЖ – папиллярная карцинома щитовидной железы; ФКЩЖ – фолликулярная карцинома щитовидной железы; МКЩЖ – медуллярная карцинома щитовидной железы.

В настоящее время проводятся исследования циркулирующих микроРНК в плазме крови в качестве потенциальных биомаркеров для ранней диагностики опухоли, ее рецидива, метастазирования. Одной из конечных целей исследований является разработка панели на основе оценок количества микроРНК, циркулирующих в плазме крови [9]. Исследования, опубликованные на сегодняшний день, ориентированы в основном на пациентов с папиллярным раком (табл. 3). В работе S. Cantara и соавт. исследовалась роль циркулирующих в крови микроРНК с целью диагностики злокачественных узловых образований ЩЖ. В исследование вошли препараты сыворотки крови с предварительным диагнозом “доброкачественные узловые образования ЩЖ” (ДУОЩЖ) (n = 12), ПКЩЖ (n = 12), препараты с отсутствием патологии в ЩЖ (n = 12). Для анализа были отобраны 8 микроРНК (-579, -95, -29b, -501-3p, -548d-5р, -190, -362-3p, -518a-5р). В результате исследования был выявлен повышенный уровень экспрессии в сыворотке крови следующих микроРНК: -579, -95, -29b, -190 в образцах с диагнозом ПКЩЖ по сравнению с доброкачественными образованиями. Вторым этапом исследования стала проверка уровня экспрессии 4 микроРНК во второй исследуемой группе пациентов (ПКЩЖ (n = 79), узловой зоб (n = 80), препараты с отсутствием патологии в ЩЖ (n = 41)). В результате выявлено повышение уровня экспрессии микроРНК-190 в группе ПКЩЖ по сравнению с группами “доброкачественные образования ЩЖ”, “отсутствие патологии в ЩЖ”, снижение уровня экспрессии микроРНК-579, -95, -29b. Статистически значимых различий в уровне экспрессии микроРНК при сравнении подгруппы доброкачественных узловых образований и препаратов с отсутствием патологии в ЩЖ получено не было. Так как при исследовании сыворотки крови авторами были получены достоверные различия в уровне экспрессии микроРНК между подгруппами ПКЩЖ и доброкачественных узловых образований, было принято решение определить уровень экспрессии данных микроРНК в тканях ЩЖ с диагнозами ПКЩЖ и ДУОЩЖ. В результате было обнаружено, что уровни экспрессии микроРНК-579, -95, -190 в тканях ЩЖ совпадают с уровнями экспрессии, полученными в сыворотке. Наибольшая диагностическая точность была получена для микроРНК-95, -190. Авторы делают вывод, что данные микроРНК могут быть использованы для дифференциальной диагностики узловых образований ЩЖ.

1. Yu и соавт. в 2012 г. впервые исследовали сывороточные микроРНК в ПКЩЖ и определили три микроРНК (-let-7e, -151-5p, -222), уровень экспрессии которых был повышен у пациентов из Китая с диагнозом папиллярного рака по отношению к доброкачественным образованиям [44]. M.E. Graham и соавт. провели количественную оценку 128 микроРНК в сыворотке крови 31 пациента, у 13 из которых диагностировалась ПКЩЖ. В результате исследования был выявлен сниженный уровень экспрессии микроРНК-146a-5p, -199b-3р и повышение уровня экспрессии микроРНК-let7b-5р, -10а-5р в сыворотке крови. Несмотря на полученные данные, различия в количестве микроРНК, выявленные в исследованиях, указывают на необходимость проведения крупномасштабного, строго контролируемого исследования, которое послужило бы основой для исследований в других популяциях с различными клиническими характеристиками [37].

Таблица 3. Циркулирующие микроРНК – молекулярные маркеры в диагностике злокачественных новообразований ЩЖ

Примечание. ↑/↓ – повышенный/сниженный уровень экспрессии микроРНК; ПКЩЖ – папиллярная карцинома щитовидной железы; ФКЩЖ – фолликулярная карцинома щитовидной железы.

В исследовании M. Li и соавт. приняли участие 56 пациентов с диагнозом ПКЩЖ, 95 пациентов с доброкачественными узловыми образованиями ЩЖ (ДУОЩЖ) и 10 пациентов без патологии в ЩЖ (контрольная группа). Исследование проводилось на базе хирургического отделения больницы Китайского медицинского университета (Шэньян, Китай). Среди 95 пациентов с ДУОЩЖ у 61 пациента выявлена аденома ЩЖ, у 34 – узловой зоб. Образцы крови были взяты у всех пациентов до и после проведения операции на ЩЖ. В результате проведенного исследования было выявлено повышенное количество микроРНК-25-3p, -451a, -140-3p и -let-7i в случаях ПКЩЖ по сравнению с доброкачественными узлами ЩЖ и группой контроля. Более высокие уровни микроРНК-25-3p и -451a были обнаружены в тканях ЩЖ у пациентов с ПКЩЖ. Кроме того, уровень экспрессии микроРНК-25-3p и -451a в крови уменьшился после иссечения опухоли. Таким образом, авторы делают вывод, что уровни микроРНК-451a и микроРНК-25-3p в плазме могут служить новыми минимально инвазивными биомаркерами для предоперационной диагностики ПКЩЖ [38].

В исследование E.E. Yoruker и соавт. были включены 86 пациентов, в том числе 31 пациент с диагнозом ПКЩЖ, которые лечились в Стамбульском университете, 31 пациент с диагнозом “многоузловой зоб ЩЖ”, 24 пациента без патологии в ЩЖ (контрольная группа). Образцы сыворотки крови пациентов с ПКЩЖ были получены до и через пять недель после операции. При анализе уровня экспрессии 7 микроРНК были получены следующие результаты: повышение уровня экспрессии микроРНК-222, -31, -151-5р и -let-7i, но снижение уровня экспрессии микроРНК-21 у пациентов с ПКЩЖ по сравнению с доброкачественными опухолями ЩЖ и контрольной группой пациентов. Послеоперационный уровень экспрессии микроРНК-222 был достоверно ниже предоперационного уровня для всех опухолей. Оценка до- и послеоперационной групп показала, что уровни экспрессии микроРНК-221 и микроРНК-222 были ниже после операции в группе пациентов с ПКЩЖ [41]. Согласно проведенным исследованиям, повышение количества микроРНК-146b, -222 в плазме крови характерно для ПКЩЖ [39, 41], а повышение количества микроРНК-21 больше характерно для пациентов с ФКЩЖ, нежели с ПКЩЖ или доброкачественными образованиями ЩЖ [43].

Диагностические панели на основе определения мутаций и уровня экспрессии генов и микроРНК

На данный момент уже создано несколько доступных коммерческих диагностических панелей, таких как классификатор экспрессии генов Afirma (Gene Expression Classifier) (GEC), ThyGenX TEST, ThyraMIR, ThyroSeq TEST [45, 46] (табл. 4). В классификаторе экспрессии генов Afirma GEС оценивается относительный уровень экспрессии микроРНК в цитологическом материале, полученном после проведения ТАБ из доброкачественных и злокачественных образований ЩЖ. Это тест, основанный на технологии микрочипов, используемой для анализа экспрессии микроРНК 167 различных генов. Эти 167 генов включают в себя два набора генов, один из которых содержит 25 генов, менее распространенных при РЩЖ, а другой – 142 гена, наиболее распространенных при РЩЖ. По результатам исследования сообщается о принадлежности узла к доброкачественным образованиям или о подозрении на рак. Тест Afirma GEC был валидизирован в слепом проспективном многоцентровом исследовании с анализом 265 узловых образований ЩЖ с неопределенной цитологией и последующим гистологическим исследованием. В 2014 г. Veracyte представил классификаторы злокачественных новообразований Afirma (AMCs) для дальнейшего улучшения теста Afirma GEС в качестве комплексного диагностического инструмента для оценки риска развития злокачественных новообразований, в том числе МКЩЖ. Тесты AMCs выполняются только на цитологическом материале после проведения ТАБ, содержащем подозрительный или злокачественный цитоморфологический диагноз или подозрительный результат Afirma GEC. AMCs включают изолированный профиль микроРНК для МКЩЖ и/или мутацию гена BRAF V600E для помощи в принятии дальнейшего клинического решения [47].

Таблица 4. Сравнение доступных в настоящее время молекулярных тест-систем для определения вероятности злокачественных изменений в цитологическом материале, полученном после проведения ТАБ ЩЖ

Тест ThyGenX разработан на основе геномных мутаций и транслокаций в гистологической ткани ЩЖ и на цитологическом материале. ThyGenX использует платформу следующего поколения (NGS) для выявления более ста генетических изменений по 8 генам, связанных со злокачественными новообразованиями ЩЖ. Он включает в себя оригинальные генетические изменения, проанализированные в тесте miRInform, а также тестирование мутации PIK3CA, которая участвует в формировании и прогрессировании фолликулярной карциномы и анапластической карциномы. Позднее был представлен новый молекулярный тест ThyraMIR. Этот тест основан на анализе 10 микроРНК: -29b-1-5p, -31-5p, -138-1-3p, -139-5p, -146b-5p, -155, -204-5p, -222-3p, -375, -551b-3p. Он используется в дополнение к тесту ThyGenXв тех случаях, когда результат теста ThyGenX неинформативен для постановки диагноза. Его диагностические характеристики: чувствительность 89% и специфичность 85% [45].

Тест ThyroSeq включает более 400 точечных мутаций и транслокаций. По мере добавления новых мутаций в панель увеличивается чувствительность, но уменьшается специфичность, полученные результаты все еще требуют проверки и дополнительной информации о применении этого теста относительно категории III, согласно заключениям современной международной цитологической классификации (Bethesda Thyroid Classification, 2017) [45].

В Институте молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск) созданы тест-системы [48, 49] на основе молекулярных маркеров – уровней экспрессии микроРНК и онкогена HMGA2, мутации в гене BRAF. Данные панели позволяют различать доброкачественные и злокачественные опухоли ЩЖ, а также дифференцировать различные типы новообразований с высокой точностью на дооперационном уровне. Согласно проведенным исследованиям, с помощью данных панелей были получены следующие результаты: при ПКЩЖ в большинстве случаев происходит повышение уровней микроРНК-221, -222 и -146b, маркером МКЩЖ выступает микроРНК-375. Разделение фолликулярной карциномы и фолликулярной аденомы оказалось более сложным и менее надежным, с диагностическими характеристиками (для выявления ФКЩЖ) [50]. Данные результаты не противоречат результатам, описанным в литературных источниках.

Заключение

Таким образом, целью молекулярного тестирования является оценка характера узлов ЩЖ и снижение цитологической диагностической неопределенности перед операцией. Нужны дополнительные исследования на крупной когорте, с более длительным наблюдением для того, чтобы определить, какой конкретно тест будет считаться точнее другого. Эксперты Американской и Европейской тиреоидологических ассоциаций, Российского общества эндокринологов продолжают обсуждение, следует ли использовать молекулярные тесты в обычной клинической практике. Хотя молекулярный анализ генетического материала ТАБ из узловых образований ЩЖ показывает большие перспективы в диагностике, прогнозе и лечении РЩЖ, в настоящее время нет достаточной доказательной базы, чтобы рекомендовать либо выступать против использования молекулярного тестирования при получении цитологического заключения неопределенных узлов ЩЖ. Отмечается, что молекулярное тестирование должно всегда выполняться и интерпретироваться в контексте клинических, ультразвуковых и цитологических данных. Молекулярный анализ – перспективный метод оценки узловых образований щитовидной железы с неопределенной цитологией, однако он требует дальнейшего изучения и совершенствования.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках бюджетной темы НИИТПМ – филиала ИЦиГ СО РАН ГЗ No 0324-2018-0001, рег. No АААА-А17-117112850280-2. Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных научных исследований по теме 0310-2018-0007.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Информация о вкладе каждого автора. Сердюкова О.С. – сбор и обработка материалов, написание текста. Титов С.Е. – редактирование текста. Малахина Е.С. – редактирование текста. Рымар О.Д. – сбор материалов, финальное редактирование текста рукописи. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили итоговую версию до публикации.